FACS

1 - color FACS Staining Procedure


1. Cell을 FACS buffer에 부유시킴 (약 10의 5제곱 cell / 50 ul 정도 되도록 함) 부착세포의 경우에는 trypsin 또는 EDTA 등을 활용하여 부유시킨다. 이때 trypsin 등의 처리에 의해 표적의 표면 분자가 영향을 받는 경우에는 기타 방법을 고려하여야 한다.

2. 50 ul을 tube에 분주한다.

3. 50 ul의 항체를 첨가한다. 일반적으로 5 ug / ml 의 항체 농도가 되도록 항체를 첨가한다. 그러나, 적용하는 최적의 항체 농도를 결정하기 위해서는 각각의 항체별로 titration을 하여 적정한 항체 농도를 결정하여야 한다.

4. 냉장 또는 on ice 상테에서 1시간 배양한다. (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다.)

5. 1ml 의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.

6. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.

7. 50 ul의 2nd Ab를 첨가한다. FITC/PE-conjugated (Fab)'2 타동물 유래의 anti-1차 항체 유래 동물의 항체 Ab (세포가 유래된 동물의 Ig으로 absorbed) 를 사용하면 가장 이상적이다. 그러나 일반적으로 Fluorescence-label된 타동물의 항 1차 항체  Ab를 사용하며 이 경우에 1차 항체 적용 단계가 끝난 후 (제 6단계후), 2~10% 의 2차 항체 생성동물의 serum을 이용하여 30분 정도 blocking 단계를 추가한다.

8. 냉장 또는 on ice 상태에서 1시간 배영한다 (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다)

9. 1ml의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.

10. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.

11. 200ul의 staining buffer (PI solution을 첨가한 것 사용) 에 재부유시켜서 즉시 FACS 분석을 실시한다. (PI solution이 세포에 적용된 이후에는 5분 이내에 FACS 분석에 사용하고 늦어도 10분 안에는 FACS 분석을 끝내는 것이 좋다)

12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)


Intracellular stain 법

위의 protocol을 사용하는데, step 1 후에 다음의 과정을 추가한다.
(intracellular stain을 위한 kit를 구입하여 실시하면 더욱 간편하다.)

1) Cell을 고정시킨다.
 - 고정액은, ethanol, acetone, 1% Paraform aldehyde, 1% formalin 등을 사용할 수 있다.
 - 10분 정도 실온에서 고정한 후에, 충분한 양의 FACS buffer로 wash해 준다.

2) 고정된 세포막에 항체가 통과할 수 있는 pore를 만들기 위한 처리를 해준다.
 - 일반적으로 (0.1% saponin, 0.5% BSA, 0.02% NaN3 in PBS) 액을 사용한다 (BSA나 NaN3는 생략가능)
 - 실온에서 약 20분 배양한다.

3) 위의 protocol에서 step2 이후를 동일하게 실시한다.

필요한 시약 및 참고사항

- 항체 : 항체는 대체로 100~500ug.ml의 농도로 공급되며 필요한 양 만큼만을 따다가 희석해 놓는다. (10X로 희석), 즉 500ug/ml의 원액항체의 경우 300ul의 10X 항체액을 만들 경우, 30ul의 항체원액을 따다가 270ul의 항체 희석액을 섞어서 만든다. (원액항체는 분주하지 않고 보관함.) 희석한 항체는 4도씨에서 보관한다.
(새로운 항체를 이용할 때는 항체를 계단 희석하여 가장 최적의 항체농도를 결정한 후에 사용해야 한다. 그러나 일반적으로 1~5ug/ml의 농도가 적당하다)

- 항체 희석액 : PBS containing 0.02% sodium azide (NaN3), 0.1% BSA

- FACS buffer : PBS containing 0.01% sodium azide, 2~5% serum (염색하고자 하는 세포가 유래한 동물종의 serum) (serum을 넣는 것은 Fc receptor의 blocking 용이므로 Fc receptor가 없는 세포의 경우에는 안넣어도 됨). high background sample의 경우에 세포가 유래한 동물의 serum을 2~10% 첨가하면 background stain을 낮출 수 있다.
참고) Blocking을 위해서 2) 단계 다음에, 항체를 만든 동물의 serum 2~5%를 첨가한 PBS를 100ul 넣어주고 30분간 배양하여 우너심으로 상청액을 제거하고 90ul의 FACS buffer에 재부유시켜 3)의 단계로 진행하기도 한다.

Propidium Iodide (PI)
- Stock solution으로 0.5 mg/ml로 만들어서 냉동보관 (-20도)
- staining buffer에 1/200으로 희석하여 사용



* 실험에서 사용한 Protocol *