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FACS
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12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)<br />
<br /><br /><font style="BACKGROUND-COLOR: #ccffcc" size="4"><strong>Intracellular stain 법<br /><br /></strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffffff" size="2">위의 protocol을 사용하는데, step 1 후에 다음의 과정을 추가한다.<br />(intracellular stain을 위한 kit를 구입하여 실시하면 더욱 간편하다.)<br /><br />1) Cell을 고정시킨다.<br /> - 고정액은, ethanol, acetone, 1% Paraform aldehyde, 1% formalin 등을 사용할 수 있다.<br /> - 10분 정도 실온에서 고정한 후에, 충분한 양의 FACS buffer로 wash해 준다.<br /><br />2) 고정된 세포막에 항체가 통과할 수 있는 pore를 만들기 위한 처리를 해준다.<br /> - 일반적으로 (0.1% saponin, 0.5% BSA, 0.02% NaN3 in PBS) 액을 사용한다 (BSA나 NaN3는 생략가능)<br /> - 실온에서 약 20분 배양한다.<br /><br />3) 위의 protocol에서 step2 이후를 동일하게 실시한다.<br /><br />필요한 시약 및 참고사항<br /><br />- 항체 : 항체는 대체로 100~500ug.ml의 농도로 공급되며 필요한 양 만큼만을 따다가 희석해 놓는다. (10X로 희석), 즉 500ug/ml의 원액항체의 경우 300ul의 10X 항체액을 만들 경우, 30ul의 항체원액을 따다가 270ul의 항체 희석액을 섞어서 만든다. (원액항체는 분주하지 않고 보관함.) 희석한 항체는 4도씨에서 보관한다.<br />(새로운 항체를 이용할 때는 항체를 계단 희석하여 가장 최적의 항체농도를 결정한 후에 사용해야 한다. 그러나 일반적으로 1~5ug/ml의 농도가 적당하다)<br /><br />- 항체 희석액 : PBS containing 0.02% sodium azide (NaN3), 0.1% BSA<br /><br />- FACS buffer : PBS containing 0.01% sodium azide, 2~5% serum (염색하고자 하는 세포가 유래한 동물종의 serum) (serum을 넣는 것은 Fc receptor의 blocking 용이므로 Fc receptor가 없는 세포의 경우에는 안넣어도 됨). high background sample의 경우에 세포가 유래한 동물의 serum을 2~10% 첨가하면 background stain을 낮출 수 있다.<br />참고) Blocking을 위해서 2) 단계 다음에, 항체를 만든 동물의 serum 2~5%를 첨가한 PBS를 100ul 넣어주고 30분간 배양하여 우너심으로 상청액을 제거하고 90ul의 FACS buffer에 재부유시켜 3)의 단계로 진행하기도 한다.<br /><br />Propidium Iodide (PI)<br />- Stock solution으로 0.5 mg/ml로 만들어서 냉동보관 (-20도)<br />- staining buffer에 1/200으로 희석하여 사용<br /></font><br /></font></font>
