시퀀싱 (sequencing)

                                                          
                                                               DNA 염기서열 분석 (Sequencing)

 DNA의 sequencing은 1977년에 이르러 거의 동시에 개발된 두 가지 방법에 의해 가능하게 되었다.
그 두 가지 방법은 F. Sanger와 A. R. coulson이 개발한 chain termination 방법과 A. Maxam과 W. Gilbert의 chemical degradation 방법이 있으나 현재 주로 사용되는 방법은 Chain termination이다.

<Chain termination 방법의 원리>
DNA 중합효소가 주형 DNA에 상보적인 DNA를 합성할 때 사용하는 기질은 dNTP이다.
dNTP의 3′위치 탄소에는 -OH기가 붙어 있는데 , 이 -OH기의 산소 원자에 다음 dNTP가 연결되어 이어지게 된다.
그런데, 만약 3′위치에 산소원자가 없고 동위원소로 표지가 된 dideoxy NTP(ddNTP)를 넣어주면 다음 dNTP를 붙일 수 없으므로 DNA 합성이 정지(termination)되고 전기영동을 하면 동위원소로 표지가 되어있기 때문에 UV를 쬐이면 발광을 하게 된다. 그러나 이 방법은 모두 4번의 전기영동을 해야하는 번거로움을 가지고 있다. 왜냐하면 A,T,G,C를 이와 같은 방법으로 한꺼번에 전기영동을 해주면 서로 구분이 가지 않기 때문이다.


현재는 이런 번거로움을 해소하기 위하여 서로 다른 색을 띄는 형광색소를 각각의 뉴클레오타이드에 표지를 해서 한꺼번에 전기영동을 해도 구분이 가능하게 만들어 놨다. 이런 방법을 automatic sequencer이라 하며 훨씬 편하고 빠르고 정확하게 염기서열을 분석할 수 있다 .sequencer는 시료를 gel running시키는 본체와 결과를 분석하는 컴퓨터가 연결되어 있고 Gel running시 DNA 조각이 본체의 read region에 이르면 argon laser beam이 DNA에 표지된 형광색소를 활성화시키게 된다. 이를 빛의 강도에 따라 CCD 카메라가 선택적으로 인지하여 software에 집결시키면 컴퓨터 화면상에 gel file로 나타난다.

<과정>
1. Denaturation(변성) 
2. Annealing(접합)
3. Labeling reaction(표지반응)
4. Temination reaction(종결반응)

사용하는 DNA가 단일가닥일 때에는 상관이 없지만, 이중가닥일 경우 primer(시발체)가 바로 결합할 수 없기 때문에 변성과정을 거친후 진행을 해야한다. 이중가닥을 분리하는 방법중 주로 쓰이는 것은 NaOH, EDTA를 가한 후, ethanol로 침전시키면 된다. 그후 시발체를  정확하게 상보적인 염기를 갖는 위치로 찾아가서 붙게 된다. 이때 온도가 맞지 않거나 너무 짧으면면 시발체가 엉뚱한 곳에 붙을 수 있으므로 주의해야 한다. 시발체로부터 시작되어 DNA확장이 진행이 되면서 방사성동위원소로 표지된([α-35S] dATP)이 끼어 들어가는 과정이 시작된다. dNTP와 효소(enzyme) 등을 넣고 상온(25℃)에서 2∼5분간 반응시킨다. 참고로 이때 시간이 너무 길어지거나 온도가 너무 높아지게 되면 시발체에서 가까운 곳의 염기 서열을 읽는데 지장이 있게 된다. 또한 여러 가지 용액을 섞어줄 때에는 특별한 경우를 제외하고, 중요하지 않은 것부터 넣는 것이 일반적인 순서이며 효소는 항상 맨 마지막에 넣는다. 마지막으로 dNTP의 농도가 높고 온도(37℃)도 적당하기 때문에 확장 (extension)이 활발하게 일어난다.
확장 도중에 dNTP 대신 ddNTP가 끼어 들어가면 반응이 더 이상 진행되지 못한다. 즉, 반응이 종결되며 전기영동을 하여 표지된 순서를 아래서부터 위로 차례대로 읽으면 그것이 원하는 염기순서가 되는 것이다.