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* 반응 산물을 확인하기 위해서는 acrylamide gel 보다 사용하기 편리한 agarose gel을 더 많이 이용한다. 그러나, 100bp 이하의 반응 산물을 확인해야 할 경우에는 agarose gel 상에서 구별이 어려운 경우가 있으므로 acrylamide gel (12%)을 사용하면 더 분명하게 확인할 수 있다.<br />
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# PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점 <br />
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1. Template DNA<br />
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선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병우너체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA (cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을 대 만응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의햐여 한다.<br />
Chromosomal DNA인 경우 1ug 이내, plasmid DNA의 경우 100pg~100ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA 양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.<br />
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2. Primer<br />
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Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20bp 내외의 염기서열에 대응하는 pligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.<br />
G+C 비율이 반 정도 되게 디자인하는 것이 primer와 template 간의 결합력을 강하게 유지하는 데 도움이 되며 G+C 함량이 많을 경우에는 annealing 온도를 높이면 되지만, 무엇보다도 양쪽 primer의 annealing 온도를 비슷하게 만들어야 한다. 또한 양쪽 primer가 서로 상보적인 염기 결합이 일어나지 않도록 하고 가능하면 반응산물내에 있는 DNA 염기서열을 분석하여 비특이 DNA가 생성되지 않고록 고안해야 한다. Primer의 디자인이 PCR 반응의 성공 유무의 90%를 차지한다고 할 수 있기 때문에 합성하기 전에 신중히 고려해야 할 것이다. Primer의 합성은 염기서열을 적어 회사에 의뢰하면 주문에 따라서 정제도 해준다. 정제는 Sep-pak, OPC나 PAGE 정제를 이용하는데, 가능하면 PAGE 정제된 primer를 쓰도록 한다.<br />
Primer의 양은 0.1~0.5uM로 시행한다.<br />
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3. dNTP (deoxynucleotide triphosphate)<br />
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시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP (각각 100mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20~200 uM 정도를 사용한다.<br />
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4. 10x PCR 완충용액<br />
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1) Magenesium<br />
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다음과 같은 여러 가지에 영향을 주는 중요한 요소이다.<br />
A. Primer가 template DNA에 결합하는 능력<br />
B. Template 및 PCR 산물의 변성온도<br />
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</font></p>