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[[image : genomic.jpg]]<br />
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<strong><br /><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">A. Genomic DNA로부터 특정 유전자 부위의 증폭</font></strong><br />
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<strong>실험 방법</strong><br />
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1. 실험에 이용할 PCR 시험관에 다음과 같이 실험에 사용할 재료들을 혼합하고 pipette으로 잘 섞는다.<br />
Tap DNA polymerase (1 unit/ul) <strong>1ul</strong> (총 부피 <strong>50ul</strong>)<br />
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* 10x PCR 완충용액 (100mM Tris-Cl, pH 8.3, 500mM KCl, 15~20 mM magnesium chloride, 0.01 % gelatin 또는 bovine serum albumin [BSA])은 효소에 딸려오는 것을 사용하면 되지만, MgCl2 농도를 변화시킬 필요가 있는 경우에는 Mg-free 완충용액을 사용해야 한다.<br /><br />* 여러 명의 다른 환자 혈액에서 분리한 template와 같은 primer로 증폭하려 할 때에는 template를 제외한 다른 성분을 한꺼번에 섞은 PCR mix를 만들어서 쓰면 좋다.<br /><br />* 위 반응은 단지 예일 뿐이며 모든 성문은 PCR 반응마다 여러번 실험을 반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다. 각 조성마다 고려해야 할 점과 주의 사항은 아래에 따로 정리하였다.<br /><br />* 최근에 나오는 PCR 기계에 맞는 PCR 시험관은 크기가 작고 얇아서 열 전도가 잘 되도록 된 것이다. 작아서 다루기는 어렵고 비싸지만 반응이 잘 일어나기 때문에 많이 쓰인다.<br /><br />* 중합효소 연쇄반응은 대단히 민감한 반응이다. 위의 여러가지 시약들이 조금이라도 다른 물질에 오염되거나 더러운 tip을 쓰는 경우 false positive 반응이 나오는 확률이 아주 높으므로 반드시 깨끗한 시약을 조금씩 덜어서 쓰도록 하고 오염이 의심되면 버려야 한다.<br /><br /><br />2. 혼합한 시료를 PCR 기계에 넣고 다음과 같은 프로그램으로 PCR을 시작한다.<br /><br /><table cellspacing="1" cellpadding="1" width="200" summary="" border="1"> <tbody> <tr> </tr> <tr> </tr> <tr> </tr> <tr> </tr> </tbody></table><table style="WIDTH: 651px; HEIGHT: 83px" cellspacing="1" cellpadding="1" width="651" summary="" border="1"> <tbody> <tr> <td bgcolor="#cccccc"> </td> <td bgcolor="#cccccc"><strong> Denature</strong></td> <td bgcolor="#cccccc"><strong> Annealing</strong></td> <td bgcolor="#cccccc"><strong> Polymerization</strong></td> <td bgcolor="#cccccc"><strong> Cycle 수</strong></td> </tr> <tr> <td><strong> Cycle1</strong></td> <td> 94도씨, 5분</td> <td> 60도씨 30초</td> <td> 72도씨 30초</td> <td> 1 cycle </td> </tr> <tr> <td><strong> Cycle2</strong></td> <td> 94도씨, 30초</td> <td> 60도씨 30초</td> <td> 72도씨 30초</td> <td> 30 cycles</td> </tr> <tr> <td><strong> Cycle3</strong></td> <td> 94도씨, 30초</td> <td> 60도씨 30초</td> <td> 72도씨 10분</td> <td> 1 cycle</td> </tr> </tbody></table><br />* 위 반응은 단지 예일 뿐이며 annealing 온도와 각 시간은 PCR 반응마다 여러번 실험을 반복하면서 최적 조건을 결정하여 사용해야 한다.<br /><br />* 옛날에는 혼합액 위에 증발을 방지하기 위해서 mineral oil을 얹어야 했지만, 최근의 많은 기계와 시험관은 이런 과정이 필요없도록 뚜껑 쪽에서 가열하게 되어 있다.<br /><br /><br />3. 반응이 끝나면 10~20ul 정도 반응액으로 전기영동을 실시하여 반응 산물을 확인한다.<br /><br />* 반응 산물을 확인하기 위해서는 acrylamide gel 보다 사용하기 편리한 agarose gel을 더 많이 이용한다. 그러나, 100bp 이하의 반응 산물을 확인해야 할 경우에는 agarose gel 상에서 구별이 어려운 경우가 있으므로 acrylamide gel (12%)을 사용하면 더 분명하게 확인할 수 있다.<br /><br /><br /><br /></font></p>
