(참고사항) 혈청학적 방법
혈청학이란 특정한 항원에 대한 항체가 포함된 항혈청을 이용해 연관된 항원의 존재를 확인하는 방법이다. 이 방법은 항혈청 내에 있는 항체를 이용한 항원 - 항체 반응을 검사하는 방법으로 임상실의 기초적인 실험 방법이 되고 있다. 항체를 이용한 일반 실험에서도 항원을 확인하는 중요한 실험법들이 된다. 이러한 방법에는 ELISA 법 외에도 다음의 여러 가지 방법들이 있다.
(참고 : 인제대학교 면역학 실험 노트)
1. 면역 침강법 (immunoprecipitation)
면역 침강법은 물에 녹아서 침전이 형성되지 않는 항원을 항체를 이용하여 항원 - 항체 복합체의 침전을 형성하게 하여 항원의 존재를 확인하는 방법이다. 이 방법은 일반적으로 단백질과 같은 수용성 항원을 확인할 때 이용된다.
침전의 형성은 항원이 너무 많거나 항체가 너무 많아도 형성되지 않으며, 언제나 항원과 항체의 역가가 일치하는 등가의 지역 (zone of equivalence) 에서 얻어진다. 그러므로 용액상태에서 침전을 얻고자 할 때에는 항원 - 항체의 등가의 지역이 어디인지 예비실험을 통하여 확인하여야 한다. 일반적으로 등가의 지역은 항원이나 항체의 농도를 달리하여 반응시키고 침전의 생성 유무를 확인함으로서 구할 수 있다.
1) 용액 상태의 면역침전법
2) 면역확산법 (immunodiffusion analysis)
2. 응집법 (agglutination)
응집법은 항원과 항체가 만나서 입자들이 서로 덩어리지는 것을 말한다 (clumping). 일반적으로 세포와 같이 물에 녹지 않는 입자 상태의 항운이 항체와 결합하여 침전되지 않고 서로 엉켜있는 상태를 형성하는 것을 응집이라 부른다. 응집반응은 항체가 응집소 (agglutinin) 으로 작용하여 마치 다리처럼 (bridge) 응집원 (agglutinogen, 항원) 을 서로 연결시켜 (interconnect) 눈으로 확인할 수 있는 반응이다. 일반적으로 IgM 급의 항체가 IgG 급의 항체에 비하여 응집능력이 훨씬 높다.
a) 능동응집법 (active agglutination)
이 방법은 입자상태의 항원을 항체가 직접 결합하여 입자를 응집시키는 방법을 말한다. 혈액형 검사에 이용되는 혈구응집법 (hemmaglutination) 은 대표적인 능동응집법으로 적혈구에 대한 항원 - 항체 반응을 확인할 때 사용한다.
b) 수동응집법 (passive agglutination)
수용성인 항원을 미리 입자에 결합시켜 물에 녹지 않는 입자상태로 전환시킨 후, 그 항원에 대한 항체를 이용하여 입자가 응집되는 것을 확인한다. 양의 적혈구 (SRBC) 에 수용성 항원을 결합시켜 사용하기도 하며, 인공적인 고무입자 (latex polymer) 에 항원을 결합시켜 응집 반응에 이용하기도 한다.
c) 응집방해 (agglutination inhibition)
응집 반응이 일어나는 것을 특정한 항ㅊ테가 억제하는 현상을 말하며, 주로 혈구응집기능이 있는 바이러스에 대한 항체 유무를 확인할 때 사용한다. 바이러스의 항원 중에는 혈구를 응집시키는 항원이 있다. 이 경우, 바이러스의 혈구 응집원에 대한 항체는 바이러스 항원이 혈구 응집을 하는 것을 억제할 수 있다. 이러한 현상을 이용하여 바이러스 항원에 대한 항체가 생성되었는 지를 확인하는 방법을 혈구응집방해 (hemagglutination inhibition, HI)라고 부른다.
3. 방사능 면역시험법 (radio-immuno assay, RIA)
표준되는 항원을 방사능으로 표지하여, 항체와 면역 침전시킨다. 이때, 방사능으로 표지되지 않은 항원 (시료) 를 넣어주면, 방사능 표지된 표준항원의 침전이 줄어들게 되어, 침전속의 방사능이 줄어든다. 침전 속의 방사능 양이 줄어드는 정도를 측정하여 시료 중의 항원의 양을 측정한다.
이 방법은 항원의 양을 측정할 때 측정할 때 널리 사용되었으며, 매우 민감한 방법이나, 방사능을 사용한다는 단점이 있다. 현재는 많은 경우 효소결합면역흡착법으로 대치되고 있다. 고체 방사능 면역시험법 (solid phase RIA, SRIA) 은 일반적인 RIA를 개선한 방법으로 항원을 미리 고체로 된 매질에 결합시킨 후, 방사능 표지된 항체와 반응시킨 다음, 항원과 결합되어 있는 방사능 항체의 양을 측정하는 방법이다.
4. 면역조직화학적 기술 (immunohistochemical techniques)
항체를 이용하여, 세포나 조직을 분석하는 방법으로, 세포나 조직에 특정한 항우너의 존재유무나 항우너의 양과 위치를 조사하는 데 유용하게 사용된다. 형광물질과 결합된 항체, 효소가 결합된 항체, 그리고 금과 같은 금속이 결합된 항체 등을 이용하여 세포내의 항원의 존재나 조직내의 항원의 존재를 확인할 수 있다.
a) 면역형광시험법 (immunofluorescence assay, IFA)
b) 면역전자현미경법 (immunoelectron microscopy)
5. 보체 고정 (complement fixation)
항원 - 항체 복합테는 보체의 활성화를 유도할 수 있다. 특히, IgM, IgG1, IgG2, IgG3급의 항체가 적혈구에 결합되었을 때, 보체를 넣어주면 적혈구가 파괴된다. (보체매개성 용해, complement mediated lysis) 이 적혈구의 용혈현상을 이용하여 항체생성 유무를 확인하는 방법을 보체고정법이라고 한다. 항원 - 항체 복합체가 들어있는 용액에 보체를 넣어주면, 보체활성화로 인하여 보체 용액 내의 보체들이 모두 활성화되어 기존의 보체들이 사라지게 된다. (보체고정, complement fixation) 이 보체가 고갈된 용액을 다시 항체가 결합된 적혈구 용액에 넣어주어도 더 이상 보체활성화가 유도되지 않아 적혈구의 용혈을 관찰할 수 없다.
6. 유세포분석법 (flow cytometry)
형광항체를 이용하여 세포를 확인하고 분리하는 방법으로 세포 하나 하나에 결합된 형광항체의 양을 레이저로 검출하는 장치를 말한다. 이 방법을 사용하면 세포에 어떤 항원이 얼마나 존재하는 지도 알 수 있고 그것을 이용하여 세포를 분리 정제할 수도 있다.