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FACS
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<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ccffcc" size="4">1 - color FACS Staining Procedure</font></strong><br />
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<font size="2">1. Cell을 FACS buffer에 부유시킴 (약 10의 5제곱 cell / 50 ul 정도 되도록 함) 부착세포의 경우에는 trypsin 또는 EDTA 등을 활용하여 부유시킨다. 이때 trypsin 등의 처리에 의해 표적의 표면 분자가 영향을 받는 경우에는 기타 방법을 고려하여야 한다.<br />
<br />
2. 50 ul을 tube에 분주한다.<br />
<br />
3. 50 ul의 항체를 첨가한다. 일반적으로 5 ug / ml 의 항체 농도가 되도록 항체를 첨가한다. 그러나, 적용하는 최적의 항체 농도를 결정하기 위해서는 각각의 항체별로 titration을 하여 적정한 항체 농도를 결정하여야 한다.<br />
<br />
4. 냉장 또는 on ice 상테에서 1시간 배양한다. (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다.)<br />
<br />
5. 1ml 의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
<br />
6. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
<br />
7. 50 ul의 2nd Ab를 첨가한다. FITC/PE-conjugated (Fab)'2 타동물 유래의 anti-1차 항체 유래 동물의 항체 Ab (세포가 유래된 동물의 Ig으로 absorbed) 를 사용하면 가장 이상적이다. 그러나 일반적으로 Fluorescence-label된 타동물의 항 1차 항체 Ab를 사용하며 이 경우에 1차 항체 적용 단계가 끝난 후 (제 6단계후), 2~10% 의 2차 항체 생성동물의 serum을 이용하여 30분 정도 blocking 단계를 추가한다.<br />
<br />
8. 냉장 또는 on ice 상태에서 1시간 배영한다 (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다)<br />
<br />
9. 1ml의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
<br />
10. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
<br />
11. 200ul의 staining buffer (PI solution을 첨가한 것 사용) 에 재부유시켜서 즉시 FACS 분석을 실시한다. (PI solution이 세포에 적용된 이후에는 5분 이내에 FACS 분석에 사용하고 늦어도 10분 안에는 FACS 분석을 끝내는 것이 좋다)<br />
<br />
12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)<br />
</font>
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<font size="2">1. Cell을 FACS buffer에 부유시킴 (약 10의 5제곱 cell / 50 ul 정도 되도록 함) 부착세포의 경우에는 trypsin 또는 EDTA 등을 활용하여 부유시킨다. 이때 trypsin 등의 처리에 의해 표적의 표면 분자가 영향을 받는 경우에는 기타 방법을 고려하여야 한다.<br />
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2. 50 ul을 tube에 분주한다.<br />
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3. 50 ul의 항체를 첨가한다. 일반적으로 5 ug / ml 의 항체 농도가 되도록 항체를 첨가한다. 그러나, 적용하는 최적의 항체 농도를 결정하기 위해서는 각각의 항체별로 titration을 하여 적정한 항체 농도를 결정하여야 한다.<br />
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4. 냉장 또는 on ice 상테에서 1시간 배양한다. (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다.)<br />
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5. 1ml 의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
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6. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
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7. 50 ul의 2nd Ab를 첨가한다. FITC/PE-conjugated (Fab)'2 타동물 유래의 anti-1차 항체 유래 동물의 항체 Ab (세포가 유래된 동물의 Ig으로 absorbed) 를 사용하면 가장 이상적이다. 그러나 일반적으로 Fluorescence-label된 타동물의 항 1차 항체 Ab를 사용하며 이 경우에 1차 항체 적용 단계가 끝난 후 (제 6단계후), 2~10% 의 2차 항체 생성동물의 serum을 이용하여 30분 정도 blocking 단계를 추가한다.<br />
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8. 냉장 또는 on ice 상태에서 1시간 배영한다 (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다)<br />
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9. 1ml의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
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10. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
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11. 200ul의 staining buffer (PI solution을 첨가한 것 사용) 에 재부유시켜서 즉시 FACS 분석을 실시한다. (PI solution이 세포에 적용된 이후에는 5분 이내에 FACS 분석에 사용하고 늦어도 10분 안에는 FACS 분석을 끝내는 것이 좋다)<br />
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12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)<br />
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