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<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffffff" size="2"><font style="BACKGROUND-COLOR: #00ffff" size="4">Immunohistichemistry (면역염색)</font><br />
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</font></strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffffff" size="2"> - 특이적인 항체(antibody, 이하 Ab)로 세포, 조직 내의 target 항원(antigen, 이하 Ag)의 위치와 분포 동정이 목적<br />
- Ab는 형광물질(fluorescent), colorimetric label이 붙어 있어, label 위치로 taget target Ag의 위치를 파악할 수 있는 것임.<br />
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</font><font size="2"><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffffff"><strong>Protocol 1<font style="BACKGROUND-COLOR: #00ff00" size="3"><br />
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Protocol 1<br />
</font><br />
1. 목적 :</strong> cytokine을 monoclonal Ab (단일클론항체)를 이용하여 indirect staning!!<br />
ex) IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-r, TNF-α<br />
5) TBS/ Saponin으로 slide washing (3번 * 3분)<br />
6) TBS/ Saponin으로 1/100으로 희석시킨 goat serum을 20분간 처리하여, non-specific한 binding site를 block<br />
7) Ab로 4도씽[서 4도씨에서 overnight incubation<br /> 8) TBS/ Saponin으로 slide washing (4번), biotin이 붙은 secondary Ab(이하 2nd Ab)로 30분간 slide와 incubation<br /> 9) Avidin-biotin-peroxidase를 첨가한 후, distilled water(증류수, 이하 D.W)에 희석시킨 0.5mg/ml DAB solution으로 slide를 incubation시킨다. 그러면 Ag-primary Ab의 정도가 갈색 침전 (precipitate)이 생기게 되어, 이것으로 peroxidase activity를 측정한다.<br /> 10) TBS로 slide washing (4번)<br /> 11) Hematoxylin으로 1분간 counterstaining (착색)<br /> 12) 75% -> 80% -> 100% ethanol 순서로 각각 1분씩 slide를 dehydration<br /> 13) Slide sealing<br /> 14) Optical microscope로 분석<br /><br /><br /><strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #00ff00" size="3">Protocol 2</font></strong><br /><br /><strong>1. 목적 : <br /></strong> - Intracellular phosphate residue의 indirect staining. Phosphorylation (인산화) state-specific Ab는 1) 단백질 내의 특정 residue가 인산화되었는지 확인하는데 유용하게 사용된다. 2) 인산화된 단백질의 세포내 위치 (subcellular localization) 결정한다<br /> - 단백질의 인산화는 단백질을 세포 내의 새로운 장소로 가게 한다. <br /> ex) membrane, focal adhesion, nucleus 등<br /><br /><strong>2. 재료 및 장비</strong><br /> - Sample cells/ Stimulant<br /> - Glass slides and cover slips<br /> - PBS<br /> - 3.7% & 10% formaldehyde in PBS<br /> - 10% paraformaldehyde<br /> - 0.2% Triton X-100<br /> - Methanol<br /> - 0.06% Triton X-100/ PBS<br /> - 30% H2O2<br /> - 1% BSA<br /> - Primary Ab<br /> - Secondary Ab<br /> - GelMount<br /> - Fluorescent microscope<br /> - Goat serum<br /><br /><strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">3. Protocol A</font> : Used with prostate (전립선의) epithelial cells<br /> </strong>1) Cell들을 glass cover slip에 놓고, 붙을 수 있도록 overnight 배양한다.<br /><strong> </strong>2) PBS로 1번 헹구어 준다. (rinse)<br /> 3) Formaldehyde/ PBS로 15분간 cell들을 고정시킨다. (fixation)<br /> 4) PBS로 1번 washing<br /> 5) Triton X-100을 2분간 처리<br /> 6) 1X PBS로 washing<br /> 7) PBS로 희석시킨 1st Ab로 최소 1시간 incubation<br /> 8) PBS washing (5분 * 3번)<br /> 9) PBS로 희석시킨 2nd Ab (goat anti-rabbit Ig'g FTTC)로 1시간 incubation <br /> 10) PBS washing (5분 *3번)<br /> 11) Gelmount를 이용하여 slide위에 각각의 cover slip을 mount<br /><strong> 12) Fluorescence microscope로 분석<br /><br /><br /><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">3-1. Protocol B</font> : Used with NIH3T3 and FIII cells<br /></strong> 1) Serum-free 배지에 24시간 incubation -> starve cells<br /> 2) 적당한 자극으로 cell들을 stimulation<br /> 3) 10% paraformaldehyde (in PBS)로 15분간 cell들을 고정 (fixation)<br /> 4) PBS로 3번 rinse<br /> 5) 100ml PBS에 있는 30% peroxide 1ml로 30분 incubation (peroxidase block)<br /> 6) 100% methanol로 -20도씨에서 10분간 incubation시켜 cell을 permeabilize<br /> 7) PBS로 cell rinse 3번<br /> 8) 1% BSA로 30~60분 block<br /> 9) PBS로 cell rinse 3번<br /> 10) PBS (5% goat serum + 0.25% NP40)에 들어 있는 1st polyclonal Ab (300ng/ml~1ug/ml)로 incubation<br /> 11) PBS로 3번 washing<br /> 12) 2nd Ab (at 1:2000 in 2% goat serum in PBS, ex. goat anti-rabbit Ig's)로 incubation<br /> 13) PBS로 3번 washing<br /> 14) Conjugate vector ABC kit으로 30분. 각각의 reagent (in PBS)를 20ug/ml로 희석<br /> 15) ABC reagent 첨가 (60분)<br /> 16) PBS로 3번 washing<br /> 17) DAB substrate 첨가 (각각 1ml 당 one tablet)<br /><br /><strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">3-2. Protocol C</font> : Used with Rat52, Swiss 3T3, NIH3T3 and HEK293 cells<br /></strong> 1) 10% paraformaldehyde로 RT(실온)에서 15분간 cell 고정 (fixation)<br /> 2) 100% methanol로 -20도씨에서 10분간 permeabilization<br /> 3) 1% BSA로 block<br /> 4) 1st polyclonal Ab (at 300ng/ml)로 1시간 incubation<br /> 5) Washing & fluorescein-labeled 2nd, goat anti-rabbit Ig's FITC 첨가<br /><br /><strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">3-3. Protocol D</font> : Used with Rat Brain Slices (30um floating rat brain sections)<br /></strong> 1) PBS로 5분씩 3번 washing<br /> 2) Triton X-100/ PBS (0.06%)로 30분간 permeabilization<br /> 3) PBS 5분 * 3번 washing<br /> 4) PBS에 들은 3% normal serum으로 30분간 blocking (2nd Ab가 goat Ab면 goat serum)<br /> 5) PBS에 들은 3% normal serum에 희석시킨 1st Ab로 4도씨에서 overnight incubation<br /> 6) PBS 5분 * 3번 washing<br /> 7) PBS에 희석시킨 2nd Ab (1:500~1:1000)으로 1시간 incubation<br /> 8) PBS 5분 *3번 washing<br /> 9) Fluorescent 2nd Ab의 경우, vectashield (+DAPI if nuclear marker is desired)<br /> HRP-conjugated 2nd Ab or biotin-streptavidin-HRP의 경우, substrate 첨가<br /> 10) Develop until color is visible (~10분), 100% glycerol 또는 FluormountG로 mounting<br /><strong> <br /> <br /><br /></strong> <br />
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