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<p>[[Polymerase Chain Reaction(PCR)]]</p>

<p>PCR의 원리 <br />중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105～108배까지 수 시간 내에 증폭시킬 수 있다, 이렇게 증폭된 DNA는 여러 실험에 이용하며, 실험 결과를 토대로 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.<br />특히 PCR에 사용하는 DNA 중합효소인 Taq polymerase는 고온의 온천수(72-74℃)에서 서식하는 미생물에서 분리한 것으로 72℃에서 활성이 가장 높으며 95℃ 이상의 고온에서도 매우 안정하여 PCR을 자동화시키는데 결정적인 역할을 하게 되었다. <br />PCR의 원리는 DNA의 양쪽 가닥을 주형으로 하여 원하는 DNA를 증폭시키는 방법으로 전체 DNA로부터 원하는 DNA 특정 부분을 선택적으로 증폭시.<br />DNA polymerase가 DNA합성 시작을 위해서는 외가닥 DNA의 주형이 있어야 하므로, double stand(이중가닥)으로 되어있는 주형을 고온(95℃)에서 denaturation(변성)을 시켜야 한다.<br />변성된 single stand DNA의 양 끝에 상보적으로 결합할 수 있는 작은 DNA 조각(primer)을 넣어주어 낮은 온도(50-65℃)에서 annealing(결합).<br />결합한 후에 72-74 ℃에서 Taq polymerase가 DNA 합성을 한다. 이렇게 'denaturation(변성)-annealing(결합)-extension(신장)'의 cycle이 30회 정도 반복 수행되어 DNA를 증폭킨다. 따라서 이론적으로 한 가닥의 주형으로 30회 cycle을 수행하면 230의 DNA 가닥을 얻을 수 있다. </p>

<p>&nbsp;중합효소 연쇄반응은 다음의 세 단계로 이루어진다.&nbsp;<br /><br />1) DNA의 변성(denaturation) <br />90℃～96℃로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다.&nbsp; </p>

<p>2) Primer의 결합(annealing) <br />&nbsp; 50℃～65℃에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다.&nbsp; </p>

<p>3) DNA의 합성(polymerization) <br />&nbsp; 70℃～74℃에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000～4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려 가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히 (10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다. </p>

<p>&nbsp;위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25～35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다. </p>

<p>※ PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점 </p>

<p>1. Template DNA </p>