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<font size="2"><strong><font size="4">1. Polyacrylamide gel<br />
</font></strong><br />
<font style="BACKGROUND-COLOR: #00ff00"><strong><font color="#000000" size="3">1-1. SDS - polyacrylamide gel 전기 영동 (SDS-PAGE)</font></strong><br />
<br />
</font>정제과정에서 단백질의 순도 검정에는 SDS - polyacrylamide gel 전기영동법 (SDS - PAGE) 이 가장 널리 이용되고 있다. SDS - PAGE에서는 작은 단백질일수록 빨리 이동하기 때문에 분자량 marker 와 비교함으로서, 비로소 분자량의 추정이 가능하다.<br />
<br />
SDS - PAGE를 행하기 위하여서는 우선, sample에 Sodium dodecylsulfate (SDS) 와 2-Mercaptoethanol 등을 가하여 끓인다. SDS는 음이온성의 계면 활성제로서, 단백질을 강력하게 변성시키면서 동시에 소수성의 부분 단백질의 주쇄 (backbone) 와 결합한다. 그리고, 2-Mercaptoethanol은 S-S 결합을 환원하면서 절단한다. 그 결과, 단백질은 완전히 변성하고, 복수의 subunit로부터 되어지는 경우는 해리되고, 전체가 거의 균일하게 부의 전하를 받게 되는 상태가 된다.<br />
<br />
SDS의 구조 : CH3(CH2)11SO3Na<br />
<br />
이것을 polyacrylamide gel 중에서 전기 영동하면, 원칙적으로 단백질의 형태나 성질에 관계없이 gel의 분자효과와 전하의 효과에 의해서 분자량에 따라서 분리가 가능해진다. 만약, 막 단백질, 당 단백질, 인산화 단백질, proline이 많은 단백질 등에서는 SDS 결합량이 보통의 단백질과 약간 틀리기 때문에 SDS-PAGE 상에서 보여지는 분자량은 실제의 분자량과 다소 차이가 나는 경우가 있다.<br />
<br />
단백질의 이동도는, gel의 "경도"에도 의존하기 때문에 목적하는 단백질 분자량에 반하여 적당한 gel을 만들어 사용한다. Acrylamide의 농도를 높이 할수록 경도가 높아진다.<br />
<br />
경도가 높은 gel은, 즉 편목 구조가 적어지고, 작은 단백질을 분리하는데는 적당한 gel이 될 수 있다. 분자량에 관한 정보가 전혀 없을 경우에는, 10~20% gel을 사용하고 분자량 20000부터 200000 정도의 단백질을 1매의 gel에서 검출하는 것이 가능하다. Acrylamide의 농도 구배를 이용한 gel (gradient gel) 을 사용하는 방법도 있다. <br />
<br />
<strong><br />
<font size="3">SDS - PAGE</font><br />
</strong><br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ccffcc"><br />
준비물<br />
</font></strong><br />
<strong>1) Mini gel용 전기 영동장치의 순서</strong><br />
<br />
- 영동조<br />
- 영동판 (glass제, 100*100mm 정도) 및 gel 두께가 1mm 정도 되게 space를 붙일 수 있는 것<br />
- 영동판용 packing, 또는 silicon tube (No. 0)<br />
- Comb (polyethylene제, 두께 1mm, 10~16 well)<br />
- Clip (gel 1매당 4개)<br />
- 전원 (정전류로서 20~100mA로 조절할 수 있는 것, 전기영동장치의 maker로부터 시판되고 있음)<br />
- 50ul hamilton syringe (sample apply 용, pipettman도 가능)<br />
- 5ml syringe와 19~24G의 주사침 (gel판 하단의 공기를 제거할 때 사용)<br />
<br />
<strong>2) 시약류</strong><br />
- 30% Acrylamide mixture<br />
- 0.75M Tris-HCl (pH 8.8)<br />
- 0.25M Tris-HCl (pH 6.8)<br />
- 10% SDS<br />
- N, N, N', N' - Tetramethylethylenediamune (TEMED)<br />
- 25% APS (Ammonium persulfate)<br />
- 분자량 marker<br />
- 2*sample buffer<br />
- 영동 buffer<br />
<br />
<strong>3) 시약의 조제<br />
</strong><br />
<font color="#000000"><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99"><strong>30% acrylamide mixture</strong><br />
</font></font> Acrylamide - 73g (최종농도 ; 29.2%)<br />
N-N'- Methylenebisacrylamide - 2g (0.8%)<br />
<br />
-> DW를 가하여 total 250ml이 되게 한다. 차광하여 냉장보존. 미중합의 acrylamide는 신경독이 있는 것으로 알려져 있으며, 손으로 직접 만지지 말 것 <br />
* 가호제는 N-N'-Methylenebisacrylamide 가 가장 일반적이지만 다른 것도 있음. 예를 들면 Piperazine diacrtlamide (Bio-Rad사) 는 gel의 강도가 높은 것이 있기 때문에 최근에 간혹 사용됨<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">0.75M Tris-HCl (pH 8.8)</font></strong><br />
Tris base - 90.75g<br />
<br />
-> DW를 첨가하여 약 800ml이 되게 하고, 실온에서 6N HCl로서 pH를 8.8 에 맞춘 후 1L 이 되게 mess up 한다. 냉장보존<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">0.25M Tris-HCl (pH 6.8)</font></strong><br />
Tris base - 30.25g<br />
<br />
-> DW를 첨가하여 약 800ml이 되게 하고, 실온에서 6N HCl로서 pH를 6.8 에 맞춘 후 1L 이 되게 mess up 한다. 냉장보존<br />
** Tris buffer는 온도에 의해서 pH가 변한다. SDS - PAGE는 실온에서 행하기 때문에 pH의 조정은 실온에서 행할 것. pH를 맞출 대 중화열에서 액온이 상승하면, 일단 pH를 맞춘 후 실온에서 방치하고 한 번 더 정확하게 pH를 맞춘 후 mess-up한다.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">10% SDS</font></strong><br />
SDS - 10g (10%)<br />
<br />
-> DW를 첨가하여 total 100ml 이 되게 한다. 실온 보존.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">25% APS</font></strong><br />
Ammonium Persulfate - 250mg (25%)<br />
DW - 1ml <br />
total - 약 1ml<br />
<br />
-> 차광하여 냉장 보존에서 3~4 주간 사용 가능<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">2X sample buffer</font></strong><br />
0.25M Tris-HCl (pH 6.8) - 25ml (0.125M)<br />
2-Mercaptoethanol - 5ml (10%)<br />
SDS - 2g (4%)<br />
Sucrose - 5g (10%)<br />
Bromophenol blue - 2ug (0.004%)<br />
<br />
-> DW를 가하여 total 50ml 이 되게 한다. 냉장 보존.<br />
(장기간 보존할 경우는 2-Mercaptoethanol을 넣어서 보존하는 것이 바람직하다.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">10X 영동 buffer</font></strong><br />
Tris base - 30.3g (250mM)<br />
Glycine - 144g (1.92M)<br />
SDS - 10g (1%)<br />
<br />
-> DW를 가하여 total 1L이 되게 한다. 실온 보존.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">영동 buffer</font></strong><br />
10X Running buffer - 100ml<br />
DW - 900ml<br />
total - 1L<br />
<br />
-> 실온 보존.<br />
</font>
</font></strong><br />
<font style="BACKGROUND-COLOR: #00ff00"><strong><font color="#000000" size="3">1-1. SDS - polyacrylamide gel 전기 영동 (SDS-PAGE)</font></strong><br />
<br />
</font>정제과정에서 단백질의 순도 검정에는 SDS - polyacrylamide gel 전기영동법 (SDS - PAGE) 이 가장 널리 이용되고 있다. SDS - PAGE에서는 작은 단백질일수록 빨리 이동하기 때문에 분자량 marker 와 비교함으로서, 비로소 분자량의 추정이 가능하다.<br />
<br />
SDS - PAGE를 행하기 위하여서는 우선, sample에 Sodium dodecylsulfate (SDS) 와 2-Mercaptoethanol 등을 가하여 끓인다. SDS는 음이온성의 계면 활성제로서, 단백질을 강력하게 변성시키면서 동시에 소수성의 부분 단백질의 주쇄 (backbone) 와 결합한다. 그리고, 2-Mercaptoethanol은 S-S 결합을 환원하면서 절단한다. 그 결과, 단백질은 완전히 변성하고, 복수의 subunit로부터 되어지는 경우는 해리되고, 전체가 거의 균일하게 부의 전하를 받게 되는 상태가 된다.<br />
<br />
SDS의 구조 : CH3(CH2)11SO3Na<br />
<br />
이것을 polyacrylamide gel 중에서 전기 영동하면, 원칙적으로 단백질의 형태나 성질에 관계없이 gel의 분자효과와 전하의 효과에 의해서 분자량에 따라서 분리가 가능해진다. 만약, 막 단백질, 당 단백질, 인산화 단백질, proline이 많은 단백질 등에서는 SDS 결합량이 보통의 단백질과 약간 틀리기 때문에 SDS-PAGE 상에서 보여지는 분자량은 실제의 분자량과 다소 차이가 나는 경우가 있다.<br />
<br />
단백질의 이동도는, gel의 "경도"에도 의존하기 때문에 목적하는 단백질 분자량에 반하여 적당한 gel을 만들어 사용한다. Acrylamide의 농도를 높이 할수록 경도가 높아진다.<br />
<br />
경도가 높은 gel은, 즉 편목 구조가 적어지고, 작은 단백질을 분리하는데는 적당한 gel이 될 수 있다. 분자량에 관한 정보가 전혀 없을 경우에는, 10~20% gel을 사용하고 분자량 20000부터 200000 정도의 단백질을 1매의 gel에서 검출하는 것이 가능하다. Acrylamide의 농도 구배를 이용한 gel (gradient gel) 을 사용하는 방법도 있다. <br />
<br />
<strong><br />
<font size="3">SDS - PAGE</font><br />
</strong><br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ccffcc"><br />
준비물<br />
</font></strong><br />
<strong>1) Mini gel용 전기 영동장치의 순서</strong><br />
<br />
- 영동조<br />
- 영동판 (glass제, 100*100mm 정도) 및 gel 두께가 1mm 정도 되게 space를 붙일 수 있는 것<br />
- 영동판용 packing, 또는 silicon tube (No. 0)<br />
- Comb (polyethylene제, 두께 1mm, 10~16 well)<br />
- Clip (gel 1매당 4개)<br />
- 전원 (정전류로서 20~100mA로 조절할 수 있는 것, 전기영동장치의 maker로부터 시판되고 있음)<br />
- 50ul hamilton syringe (sample apply 용, pipettman도 가능)<br />
- 5ml syringe와 19~24G의 주사침 (gel판 하단의 공기를 제거할 때 사용)<br />
<br />
<strong>2) 시약류</strong><br />
- 30% Acrylamide mixture<br />
- 0.75M Tris-HCl (pH 8.8)<br />
- 0.25M Tris-HCl (pH 6.8)<br />
- 10% SDS<br />
- N, N, N', N' - Tetramethylethylenediamune (TEMED)<br />
- 25% APS (Ammonium persulfate)<br />
- 분자량 marker<br />
- 2*sample buffer<br />
- 영동 buffer<br />
<br />
<strong>3) 시약의 조제<br />
</strong><br />
<font color="#000000"><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99"><strong>30% acrylamide mixture</strong><br />
</font></font> Acrylamide - 73g (최종농도 ; 29.2%)<br />
N-N'- Methylenebisacrylamide - 2g (0.8%)<br />
<br />
-> DW를 가하여 total 250ml이 되게 한다. 차광하여 냉장보존. 미중합의 acrylamide는 신경독이 있는 것으로 알려져 있으며, 손으로 직접 만지지 말 것 <br />
* 가호제는 N-N'-Methylenebisacrylamide 가 가장 일반적이지만 다른 것도 있음. 예를 들면 Piperazine diacrtlamide (Bio-Rad사) 는 gel의 강도가 높은 것이 있기 때문에 최근에 간혹 사용됨<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">0.75M Tris-HCl (pH 8.8)</font></strong><br />
Tris base - 90.75g<br />
<br />
-> DW를 첨가하여 약 800ml이 되게 하고, 실온에서 6N HCl로서 pH를 8.8 에 맞춘 후 1L 이 되게 mess up 한다. 냉장보존<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">0.25M Tris-HCl (pH 6.8)</font></strong><br />
Tris base - 30.25g<br />
<br />
-> DW를 첨가하여 약 800ml이 되게 하고, 실온에서 6N HCl로서 pH를 6.8 에 맞춘 후 1L 이 되게 mess up 한다. 냉장보존<br />
** Tris buffer는 온도에 의해서 pH가 변한다. SDS - PAGE는 실온에서 행하기 때문에 pH의 조정은 실온에서 행할 것. pH를 맞출 대 중화열에서 액온이 상승하면, 일단 pH를 맞춘 후 실온에서 방치하고 한 번 더 정확하게 pH를 맞춘 후 mess-up한다.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">10% SDS</font></strong><br />
SDS - 10g (10%)<br />
<br />
-> DW를 첨가하여 total 100ml 이 되게 한다. 실온 보존.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">25% APS</font></strong><br />
Ammonium Persulfate - 250mg (25%)<br />
DW - 1ml <br />
total - 약 1ml<br />
<br />
-> 차광하여 냉장 보존에서 3~4 주간 사용 가능<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">2X sample buffer</font></strong><br />
0.25M Tris-HCl (pH 6.8) - 25ml (0.125M)<br />
2-Mercaptoethanol - 5ml (10%)<br />
SDS - 2g (4%)<br />
Sucrose - 5g (10%)<br />
Bromophenol blue - 2ug (0.004%)<br />
<br />
-> DW를 가하여 total 50ml 이 되게 한다. 냉장 보존.<br />
(장기간 보존할 경우는 2-Mercaptoethanol을 넣어서 보존하는 것이 바람직하다.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">10X 영동 buffer</font></strong><br />
Tris base - 30.3g (250mM)<br />
Glycine - 144g (1.92M)<br />
SDS - 10g (1%)<br />
<br />
-> DW를 가하여 total 1L이 되게 한다. 실온 보존.<br />
<br />
<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99">영동 buffer</font></strong><br />
10X Running buffer - 100ml<br />
DW - 900ml<br />
total - 1L<br />
<br />
-> 실온 보존.<br />
</font>
