면역 염색법

면역 염색법

면역조직 (세포) 염색법은 항원, 항체 반응을 이용하고 조직이나 세포중의 항원의 존재하는 부위를 특이적으로 검출하는 방법이다. 좋은 항체를 사용하면, 목적의 항원의 분포를 명확하게 하고, 그러면 감도가 좋아진다. 한편, 이러한 방법은 어떠한 항원 물질의 검출에도 이용되지는 않는다. 이러한 방법이 유용한 것은 작제한 표본에 있어서 목적하는 물질이 충분한 항원성을 가지고, 충분량의 존재하에서 가능하다. 면역 염색법에서는, 조직이나 세포의 고정, 절편 작제, 염색의 각 과정에서 다양한 방법이 사용되어지고 있다. 최적의 결과를 얻기 위하여서는 이러한 방법으로부터 선책하는 것이다. 여기서는 염색 결과를 좌우하는 중요한 실험 조건에 관하여 설명하고, 일반적으로 실험실에서 행하여지는 방법, 조직과 세포의 염색을 위한 대표적인 조작을 표시한다. 

1. 중요한 실험조건

1) 검출법의 선택

면역 염색법은 Western blotting법과 같이 특이 항체를 적당한 marker로 표식하고, 항원을 검출하는 방법이다. Marker의 종류에 따라 효소 항체법, 형광 항체법, golr 코로이드 항체법 등이 있다. 효소 항체법에서는 불용성의 착색 물질을 생산하고, 서양 horseradish peroxidase (HRP) 나 alkaline phosphatase (ALP) 등이 있으며, 또한 형광 항체법에서는 fluorescein isothiocynate (FITC) 가 대표적인 marker로서 사용되고 있다. HRP의 기질로서는 녹색을 띠며, 3,3'-diaminobenzidine (DAB)나 적색을 나타나는 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) 가, 그리고 ALP의 기질로서는 짙은 청색을 나타내는 Nitroblue tetrazolium (NBT) 등이 사용되어지고 있다. 형광 항체법은 형광색소를 항체의 marker로서 사용하는 방법이다. 형광 현미경이 필요하지만 선명한 염색상은 설득성이 있고 미량의 항원의 검출에 유용하다. 한편 비교적 단시간에 퇴색하기 때문에 그전에 기록하여 둘 필요가 있다.

표식방법에 관하여 marker를 특이항체에 직접 표시하는 직접 표시법과 특이항체 (일차 항체) 에 대한 항체 (이차 항체 : 예를 들면 항마우스 IgG 항체) 에 표식하는 간접 표식법이 있다. 직접 표식법은 항원항체 반응이 1회에 한정하기 때문에 조작의 간격시간이 짧고, 비특이적인 염색도 적게 나타난다. 반면, 각종 항체에 효소를 표식하는 한편, 그리고 표식 반응에 의해서 항체가 활성이 낮아지는 경우도 적다. 간적 표식법은 일차 항체를 작제한 동물종에 대한 표식 이차 항체를 사용하기 위하여서는 시판되어지는 제품이 있다. 반응이 증강되어 강한 염색상이 관찰되어진다. 한편, 작업 간격과 시간이 걸리며 비특이적인 반응이 나타나기 쉽다. 항원의 검출 감도를 높이기 위하여 아주 다양한 간접 효소 항체법이 고안되어 있다. 그러한 대표적인 예로서는 AB법과 PAP법이 있다. 


면역염색의 예



면역염색 사진

A. AB법
Biotin과 avidin의 대단히 견고한 결합능을 이용한 것이다. 일차원 항체에 biotin 결합 이차 항체를 반응시키고, 다시 HRP 표식 avidin을 결합시켜 발색반응을 행한다. 편법으로서 HRP 표식 avidin의 대신에 HRP 표식 avidin과 avidin의 복합페를 결합시키는 방법이다. (ABC법) 난백 avidin은 염기성이 강하고 당을 포함한 비특이적 결합이 일어나기 쉽다. 그렇기 때문에 대신 Strepto-avidin을 사용할 경우가 많다 (SAB법이라 불려지고 있다.)

B. PAP법 
일차항체에 미표식의 이차 항체 과잉량을 반응시킨다. 계속해서, 일차 항체와 같은 종류의 동물에서 작제한 항 HRP항체와 HRP의 복합체를 결합시켜 발색하여 검출한다.


2. 항체의 선택

면역 염색에서는 의외로 질이 높은 항체를 사용하는 것이 매우 중요한 조건의 하나이다. 항체 역가가 높고 항원과의 반응이 특이적은 것을 선택한다. 시판품의 경웅에는 lot number도 고려하지 않으면 안되며, 사용하기 쉬운 loy를 중요하게 한다. Western blotting법이나 ELISA법으로 사용 가능한 항체가 면역조직염색에 사용하는 것은 한정되어 있다. SDS-PAGE로 얻어진 변성 단백질을 항원으로서 작제한 monoclonal 항체는 사용할 수 없는 경우가 많다. Polyclonal 항체는 항원 결정기가 다른 여러 종류 중에서 면역 globulin 분자가 포함되어 있으며 affinity도 다르다. 일반적으로 특이성이 낮은 background가 높게 나타나기 쉽다. 항체 제작시의 항원이 불순한 경우는 불순물질에 대한 항체가 포함되는 경우가 있다. 거기에 대하여 monoclonal 항체는 단일의 항원 결정기만을 반응시키기 위하여, 일반적으로는 특이성이 높고, 면역 조직염색에 적당하다. 한편, 염색성은 polyclonal 항체에 비하여 대개는 약하고 항원이 적어지는가 하면, 사용 불가능한 경우가 종종 있다. 그리고, 공통성이 높은 항원 결정기의 경우에는 단백질분자에 대한 특이성은 역으로 낮게 나타난다, 또한, 이차 항체는 일차 항체를 작제한 동물종에 대한 항체를 선택한다.


3. 표본의 작제

조직이나 형채를 충분히 유지하고 항원성은 가능한한 실패하지 않도록 염색 표본을 작제할 필요가 있다. 일반적으로 신선한 조직을 고정 및 포매하고 얇은 조직절편으로 한 후 slide glass에 고정한다. 표본은 파라핀 절편과 동결 절편의 2종률호 구별되어진다. 전자에서는 파라핀-포름알데하이드 등으로부터 조직을 고정한 후 파라핀으로 포매하고 절단한다. 후자에서는 드라이 아이스나 액체 질소로 조직을 동결시키고 절편을 작제한 후, 아세톤이나 파라 포름알데하이드로 간단히 고정하다. 파라핀 절편은 형태유지에 우수하고, 취급하기가 간편하고, 또한 장기간 보존이 가능한 반면, 절편 그대로 장기간 보존하고 적당한 시기에 절편한다. 파라 포름알데하이드나 글루타 알데하이드는 단백질을 고정하기 위하여 항원성이 마스크되기 쉽다. 특히 글루타 알데하이드 고정은 면역염색에 적당하다. 알데하이드 고정에 의해서 부서지기 쉬운 항원성을 활성화시키기 위하여 프로네이즈, 트립신, 펩신 등의 프로티즈 처리, 열처리, 알카리 또는 산 처리 등을 행한다. 몇 가지의 항원에 대한 프로티즈 처리로 좋은 결과를 얻고 있다. 역으로 이러한 퍼리에 의하여 항원성이 저하하는 경우도 있다. 알코올이나 아세톤에 의한 고정은 단백즐을 응고 및 침전시키기 때문에 항원성의 손실의 정도는 낮다.


4. 그 외

염색 조작에 문제가 없는 것을 확인하기 위하여 항원의 존재가 전체적으로 잘 알려진 재료를 동시에 염색한다. 비특이적인 반응이 없는 것을 확인하기 위하여 일차항체 대신에 같은 종류의 동물 유래의 IgG를 이용한 같은 검체로서 면역염색을 행한다.