단백질 추출법
1. 세포의 파괴와 분획
1-1. 동물조직
1) 원리와 기초지식
동물의 조직으로부터 목적하는 단백질을 얻기 위해서는 적합한 재료를 선택하는 것이 중요하다. 동물의 장기는 다른 종류의 다양한 세포군들로부터 구성되어 있기 때문에 균일한 세포를 분리하는 것은 어려운 일이다. 적당한 배양세포가 있다면 그것을 이용하는 방법도 생각할 수 있지만, 세포배양으로는 양적인 제한과 경제성이 문제가 된다. 여기에서는 비교저 균일한 세포가 많은 조직으로부터 세포 소기관의 분획에 대하여 설명하고자 한다. 목적한 단백질의 장기 분포와 세포내의 소재가 확실하지 않은 경우에는 여러 가지 조직을 파괴해서 그 세포 소기관을 분획하는 것이 기본적으로 필요하다. 도한 목적 단백질을 정제할 경우에는 세포를 분획하여 함량이 많은 부분의 조직을 알 필요가 있다. 세포 소기관의 분획은 조직에 따라 다른 경우가 많기 대문에 다른 실험서도 참고하는 것이 좋다.
파괴와 분획함에 있어서 조제후도 목적 단백질의 기능이 안전하게 유지되어야 하는 것과 단백질의 함유랑과 순도가 높은 것이 중요하다.
A) 기본적인 주의점
세포분획을 보다 정확하게 하기 위하여서는 동결 표준폼보다 신선한 재료를 신속하게 저온화해서 파괴하는 것이 중요하다. 또한 세포성분이 응집하지 않는 용매로 단백질의 기능이 유지되어지는 조건을 이용하여야 한다. 따라서 파괴의 도구, 사용하는 용매, 조작온도 등의 영향을 받기 쉬운 점에 많은 주의를 기울여야 한다. 특히 homogenizer 등의 유리관을 취급할 때 손이 미끄러지지 않도록 고무장갑 등을 착용하는 것을 권장하낟. 더욱이 운심분리기, 초원심 분리기 등을 조작할 때는 원심간의 balance를 정확히 맞추고 rotor의 뚜껑을 확실하게 잠그는 등 엄중한 주의를 기울여서 실험의 안전성을 고려하기 바란다.
B) 파괴의 도구
조직을 파괴하는 homogenizer로 잘 사용되는 것은 1. 포타엘베젬의 테프론 homogenizer 2. 폴리트론 homogenizer 3. 와링브렌더가 있다. 1. 포타 엘베젬형의 테프론 homogenizer는 유리관과 아주 좁은 간격이 있는 테프론봉을 회전시켜서 조직을 파괴한다. 2. 폴리트론 homogenizer는 금속의 고정 날과 회전하는 날 사이에서 조직을 파괴한다. 3. 와링브렌더는 고속의 회전날로 조직을 파괴한다. 파괴의 강도는 1, 2, 3의 순위이지만 처리 시간도 이 순서에 의하여 요구되어진다. 대량의 조직을 신속하게 처리할 경우에는 3번을 사용한다. 사용 파괴도구에 따른 세포 분획의 정도는 1, 2, 3 순으로 된다. 그 이외에 혈구 등과 같은 유리세포와 배양세포에서는 테프론 homogenizer로서 Dounce 형과 초음파 파괴장치를 사용한다. 또한 골조직등의 딱딱한 재료와 분해가 빠른 재료는 급속 동결한 뒤 파괴하는 동결 파괴법 (동결 플레스 파괴 장치도 시판되고 있음) 을 사용한다. 여기서는 1의 테프론 homogenizer를 사용한 분획법을 소개하기로 한다.
C) 세포 소기관의 분획의 원리
세포를 파고하고 얻은 homogenizer는 밀도가 다른 여러 가지 크기으 ㅣ과립이 혼재하고 있다. 분획 원심법이란 과립의 크기에 따라 침강하는 속도가 다른 것을 이용하는 분획법이다. 따라서 가장 큰 과립인 핵이 먼저 침강하고 mitochondria lysosome, 소포체 순으로 침강하다. 그리고 과립의 밀도차를 이용한 밀도구배 원심법이 있다.
D) 생체시료
간장과 뇌는 부드러운 조직이지만 똑같은 장기라도 조직의 부드러움이 다르기 때문에 homogenizer의 조건이 변한다. 일반적으로는 소형동물의 조직은 부드럽고 대형동물의 조직은 결합조직이 많고 단단하다. (rat, mouse와 rabbit, 개의 간장은 다르다) 또한 동물의 월령에 따라서도 다르며, 연령이 많은 조직은 엉성하며, 결합조직이 많아진다. 근육과 폐 등의 비교적 단단한 조직을 테프론 homogenizer로 파괴할 때는 homogenizer의 간극이 큰 것 (0.3mm 이상) 을 사용하여, 스트로크 수를 증가시킬 것을 권장한다. 또한 동물의 체모 등이 혼입되지 않도록 조심하지 않으면 homogenizer의 간극틈새에 끼어서 움직이지 않게 되며, 유리관이 파괴될 수 있다.
