단백질의 기본적인 실험 조작

Buffer 조제법 


1. Buffer (완충액)의 선택

   단백질을 용액상태에서 취급할 때에는 통상 어떤 buffer (수소 이온 buffer)를 사용하게 된다. 단백질 용액의 pH를 조절하는 목적은 단백질의 안정화, 효소 등의 활성 측정, 각종 크로마토그래피의 조건 설정 등 여러 가지가 있으므로 목적에 맞추어 buffer를 선택할 필요가 있다. 그러나 빈번하게 사용되고 있는 buffer의 종류는 한정되어 있어 몇 종류의 완충제로서 대부분의 실험에 대응하고 있다.

  Buffer를 선택할 때에는 사용하는 pH가 가장 중요한 조건이 된다. 완충제가 가지고 있는 완충능력은 pKa(해리정수의 역대수)가 최대로 되며 여기서부터 벌어지는 정도에 따라 낮아지게 되기 때문에 사용하는 pH에 따라 완충제의 종류는 제한된다. 일반적으로 pKa ±0.5 정도의 pH 범위에서 유효한 완충 작용이 얻어지며, ±1 이상 벌어진 영역에서의 사용은 희망적이지 않다. 또한 온도, 완충제의 농도 혹은 buffer의 이온조성 변화에 의해 buffer의 pH가 변동하게 되는데, 이 변동을 적게 하는 것이 중요한 경우가 종종 있다. 사용 pH 이외에는 ① 분광학적인 방법에 의한 측정과 단백질의 검출 (크로마토그래피의 경우 등)을 방해하지 않는다. ② 효소적 또는 비효소적인 반응의 경우에 완충제 자신이 변화하거나 반응을 저해하지 않는다. ③ 금속 이온과 복합체를 형성하지 않는 성질 등이 선택의 조건이 된다.


2. Buffer의 예
  
  - Glycine Buffer (pKa = 2.35)
  - Acetate buffer (pKa = 4.76)
  - MOPS buffer : 3-(N-mopholino) propanesulfonic acid (pKa = 7.15)
  - Phosphate Buffer (pKa = 7.22)
  - HEPES buffer : N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (pKa = 7.55)
  - Tricine Buffer : N-tris(hydroxymethyl) methylglycine (pKa = 8.15)
  - Tris buffer : tris(hydroxymethyl) aminomethane (pKa = 8.3)