Measuring microbial growth

Population growth는 cell 전체 무게의 약간의 구성요소의 중량 또는 cell의 숫자의 변화에 따라서 측정 가능하다.  전자의 경우는 protein, nucleic acids 또는 cells 그들 자체의 dry weight가 가능하다.  Cell을 세기 위한 다른 실험 방법 또는 존재하는 cell 무게를 어림하는 것은 다른 organisms나 다른 문제들과 잘 조화되어 있어서 여러가지 문제를 생각해 보아야 한다.

1. Direct measurements of microbial growth : Total and viable counts

총 세포의 수, 그리고 cell을 셀 수 있는 가능한 실험 방법에는 microorganisms의 단일 cell을 세기 위하여 두 가지 널리 사용되는 것이 존재한다.  각각의 절차는 그들의 힘의 강하기와 약함을 가지고, 그리고 종종 single bacterial culture에 존재하는 cell의 수를 세기 위해서 서로 다른 결과가 발생하기도 한다.

-Total cell count

Population의 cells의 총 숫자는 Direct microscopic count라고 불리는 실험 방법을, 현미경 아래에서 sample을 세어 봄으로써 측정할 수 있다.  Direct microscopic counts의 두 가지 종류로는, 하나는 slides 위에서 sample을 건조 시키는 방법이고, 다른 하나는 sample이 액체 상태에 있는 것이다.  액체 sample과 함께, 특별한 counting chambers가 사용된다.  Counting chamber에서, glass slides의 표면에 바둑판 무늬 모양의 기준 선망이 표시되어 있고, 각각이 사각형 모양으로 되어 있다.  바둑판 무늬 모양의 기준 선망 위에 그려진 각각의 사각형은 잘 알려진 총 합계의 부피이고, 매우 작지만 정확하게 측정할 수 있다.  바둑판 무늬 모양의 기준 선망의 한 단위 지역 안의 cell의 수는 현미경 아래에서 셀 수 있고, 작은 공간(chamber) 부피에서의 cell의 숫자의 측정이 가능하다.  현탁액의 적은 양의 milliliter 내 cells의 숫자의 중요성은 chamber sample의 부피 위에서 기초한 factor의 전환에 따라서 곱해줌으로써 쉽게 측정할 수 있다는 점이다.
현미경으로 cell 수를 세는 방법은 microbial cell number를 어림하는 데 빠른 방법 중 하나이다.  그러나 이 방법에서는 한계가 있다.
①죽은 cell과 살아있는 cell을 구별할 수 없고, ② 작은 cells는 세기가 어려워서 가끔 세지 못하고 놓치는 경우도 있다.  ③ 그렇기 때문에 정확하지 않을 수도 있고, ④ 현미경으로 관찰하기 때문에 염색이 필요한데, 염새깅 되지 않았을 경우에는 위상차 현미경을 필요로 한다.  ⑤ 진한 현탁액의 경우 cell의 개수가 너무 많아서 세기가 어려우므로 몇 차례의 희석이 필요하고, ⑥ cell이 고정된 상태가 아니기 때문에 전부 세기 전에 이동을 할 수도 있다.
미생물의 생태계에서, 전체 cell을 세기 위하여 자연 상태의 sample을 사용하거나, 눈으로 볼 수 있도록 cell에 맞는 특별한 염색을 해서 관찰을 한다.  DNA를 특이적으로 염색하는 시약인 DAPI는 sample의 모든 cell을 염색할 수 있다.  이와 대조적으로, fluorescent stains는 특별한 organisms 또는 그들의 핵산 probes에 붙을 수 있는 organisms의 group을 특이적으로 염색할 수 있다.  만약 cells가 낮은 densities로 나타난다면, 예를 들어 open ocean water sample의 경우, 그들은 처음에는 농도를 걸러내야 하고, 염색을 한 후에나 관찰이 가능 할 것이다.

-Viabel count

Direct microscopic counting에서, 죽은 cells와 살아있는 cells를 구분하지 못해서 두 종류 모두 세어야만 했다.  그러나, 많은 경우에서 우리는 오직 살아있는 cells만을 필요로 하고, 그래서 이러한 목적으로 인해서 viable count 실험 방법이 필요하다.  Viable cell은 두 개로 나뉠 수 있고, 자손을 생성해 낼 수 있다.  Viable count를 목적으로 하는 이러한 방법에서 사용하는 것은 촉촉한 agar medium위에 형성된 colonies의 가능한 sample의 수를 샘으로써 cells의 숫자를 결정할 수 있다.  이러한 이유에서, viable counts는 종종 plate count 또는 colony count라고 불리기도 한다.  Cell의 수를 세기 위한 절차의 이러한 종류에서 만들어지는 가정은 각각의 셀 수 있는 cell은 자랄 수 있고, 두 개로 나누어짐에 따라서 하나의 colony를 형성할 수 있다는 것이다. 어떤 염색적 절차는 또한 다양성을 나타낼 수 있다.  그러나, 이 colony를 이용한 실험 방법은 오직 살아있는 cell을 세기 위해서 필요한 방법이다.
Plate count의 목적으로 두 가지 실험 방법이 있다.  하나는 spread plate method이고 다른 하나는 pour plate method이다. 
Spread plate method에서, 특유한 희석된 culture의 부피는(대게 0.1m 또는 이보다 더 적다) 멸균 상태인 glass spreader를 사용해서 agar plate의 표면 위에 sample을 깔아준다.  그런 다음, 이 plate를 incubator에 넣고 배양한 후, colonies가 형성되면, colonies의 수를 세면 된다.  Plate의 표면이 충분히 말라서 깔린 용액이 스며들 수 있어야 하는 것은 상당히 중요하다.  이 실험을 위한 부피의 최대는 0.1ml인데 그 이유는 만약 더 많은 양을 사용하게 되면 용액이 agar에 충분히 스며들지 않아서 아마도 colones가 하나로 뭉쳐서 형성이 될 것이고, 이것은 아마도 다른 숫자를 나타나게 될 것이다.  그러므로 적은 양을 사용해야 한다.
Pour plate method는, culture의 알고 있는 부피(대게 0.1-1.0ml)가 매마른 Petri plate안에 들어가야 한다.  녹아 있는 agar medium은 benchtop에서 plate를 흔들어 줌으로써 잘 섞이게 해 주어야 한다.  왜냐하면, sample이 녹아있는 agar medium과 잘 섞여야 하고, spread plate에 비해서 더 큰 부피의 sample이 사용되기 때문이다.  그러나, organism을 세기 위한 이 실험 방법은 톡아있는 agar의 온도(~45℃- 50℃)를 간단히 버티어낼 수 있음에 틀림이 없다.  이러한 실험 방법에서, colonies는 plate 구석 구석까지 퍼질 수 있어야 하고, spread plate method와 같이 agar plate위로 용액이 올라와서는 안된다.  이 plate는 그들 스스로 닫혀 있어야 하고, 모든 colonies가 자라나면 colonies를 셀 수 있다.

-Diluting cell suspensions before plating

Spread plate와 pour plate 실험 방법 두 가지 모두, 이것은 colonies의 숫자가 너무 많지 않도록 하는 것이 가장 중요하다.  어떤 cells가 plate에 너무 많이 모여 있으면 colonies가 형성되지 않을 것이고, 어떤 colonies는 합쳐질 것이며, colonies 수를 측정 하는 데 여러가지 문제점을 만들 것이다.  또한, colonies 수가 너무 적은 것도 문제가 되고, 또는 colonies의 숫자를 세어도, 통계적인 의미가 줄어들 것이다.  이러한 이유에서, 여러 번의 반복적인 실습을 통해서 얻어낸 가장 유효한 통계학적 수치는 plate 위에서 오직 30~300 개 사이의 colonies가 자라는 것이 가장 좋다.  무엇보다도, 이것은 incubation conditions(medium, 온도, 시간)에 따라서 결정이 되는데, 주어진 organism의 coloneis의 가장 최대의 숫자가 주어질 것이고,  이러한 조건을 통해서 자라나게 된다.
적당한 colonies의 수를 얻기 위해서, cell의 수를 세기 위한 sample은 대부분 거의 모두 희석을 해 주어야만 한다.
희석을 해 줄 때는 한 번만 해 주면 접근하기가 어려워 지므로 한 번 이상 여러 번 해 주는 것이 꼭 필요하다.  하나의 sample의 10-fold 희석이 일반적으로 사용된다.  10-fold(1/10)으로 희석해 주는 것은, 예를 들어서 희석액의 4.5ml과 함께 sample의 0.5ml을 섞어주거나 또는 희석액 9.0ml과 sample 1.0ml을 섞어주면 된다.  만약 100-fold(1/100) 희석이 필요하다면, 0.05ml의 sample을 4.95ml의 희석액과 섞어주거나 또는 0.1ml의 sample을 9.9ml의 희석액과 섞어주면 된다.  둘 중 하나를 선택해서, 1/100 희석은 10-fold 희석을 두 번 연속해서 수행 해 주면 된다,  대부분의 경우, 연속적인 희석의 경우는 마지막 희석을 필요로 하기에 수행한다.  그러므로, 만약 1/10⁴의 희석이 필요하다면, 이것은 1/100희석을 두 번 수행함으로써 도달할 수 있거나, 또는 1/10 희석을 네 번 수행함으로써 도달할 수 있다.  

-Sources of error in plate counting

Cell의 수를 셀 수 있는 실험에서 얻어진 colonies의 숫자는 접종 재료의 크기와 이것의 생존력 뿐만 아니라 culture medium의 적당한 incubation 하는 시간에 따라 결정되기도 한다.  예를 들어, 만약 섞여 있는 culture를 사용한다면, plate에 침전 된 cells는 같은 비율의 colony로 자라날 수 없을 것이다,  만약 짧은 시간 동안 incubate한 cells는 최대의 숫자로 얻을 수 있는 colony 보다 훨씬 적은 수를 얻을 수 있을 것이다.  더군다나, colony의 숫자는 매우 다양하다.  만약 약간의 얇은 층의 colonies가 자라난다면, 그들은 아마도 수를 세는 동안 잃게 될 것이다.  순수 배양과 함께, colony 발달은 더욱 반복되는, 공통적인 방법으로 일어난다.
다양한 cell 수 세는 방법은 여러 가지 이유에서 많은 error를 제공한다.  Pipetting의 변덕스러움을 포함해서, sample의 비동질성, 불충분한 mixing, 그리고 다른 여러 가지의 이유에서이다.  그러므로, 만약, 얻은 sample의 colony 수를 헤아리려면, 매우 주의해야 하고, sample의 준비와 pipetting, 그리고 주요 희석의 반복적인 plate의 준비에 매우 주의를 기울여야 한다.  덩어리의 두 개 혹은 그 이상의 cells에서 하나의 colony 만 형성 될 것이다.  그래서 만약 많은 덩어리들이 sample에서 나타난다면, 실패율이 매우 낮은 상태로 sample을 셀 수 있을 것이다.  셀 수 있는 상태의 결과가 매우 깨긋한 상태라면 이 data는 종종 viable cells(하나 혹은 더 많은 cells로 구성된 colony 형성 unit)의 수 보다 colony forming units(cfu)의 수로 제공 될 것이다.  이것은 plate에서 자랄 수 있는 것들의 colony를 샜다는 것이 더 타당하다.
Viable counts 임에도 불구하고, sample에서 셀 수 있는 cells의 숫자의 가장 좋은 정보는 microbiology의 많은 지역에서 넓게 사용될 수 있다.  예를 들어, 음식, 낙농업, 의약, 그리고 aquatic microbiology에서 다양하게 셀 수 있는 colony는 일상적으로 사용될 수 있는 예이다.  이러한 재료는 높은 예리함의 효력을 가지고 있고, 단일의 셀 수 있는 cell로 구성된 sample은 이론적으로 셀 수가 있다.

-The great plate count anomaly

매우 섬세한 기술을 가지고 있지만, 토양이나 물 같은 자연 상태의 samples의 전체 cell의 수를 평가하는 데 사용 할 때는 plate counts를 믿을 수가 없다.  게다가 자연 상태의 samples의 direct microscopic count는 다른 주어진 culture medium의 plates에서 다시 발견되는 더 많은 organisms를 보여준다.
왜 plate counts 하는 것은 direct microscopic counts를 하는 것 보다 더 적은 수의 cells를 보이는 것일까?
하나의 이유는 microscopic 실험 방법은 죽은 cell도 셀 수 있지만, viable 실험 방법은 살아 있는 cell만 셀 수 있기 때문이다.
무엇보다도, 심저어 매우 작은 sample의 다른 종류의 organisms는 아마도 실험실의 culture에서의 상태와 영양분 요구량의 차이 때문에 광대하게 나타날 수도 있다.  그러므로, 하나의 medium과 growth conditions의 하나의 set는 전체 population의 부분 집합의 growth를 할당할 것이다.
만약 이 부분집합이 형성된다면, 예를 들어, 10의 9승배 cell/g의 전체 viable population에서 10의 6승배 cell/g이라면, plate count는 전체 population의 오직 0.1%만 보일 것이다.  이것은 viable cells의 실제 가능한수의 최소치이다.

2. Indirect measurements of microbial growth : Turbidity

Cell의 숫자의 측정의 유용한 실험 방법 중 빠르게 사용할 수 있는 것은 turbidity measurements이다.  Cell 현탁액은 눈으로 보았을 때 구름이 낀 것 처럼 탁하게 보이는데, 이것은 현탁액을 통과한 빛이 사방으로 흩어졌기 때문이다.  Cell이 많으면 많을수록 흩어지는 빛의 양도 많아지고, 이러한 현탁액은 더 흐리게 보인다.  Turbidity는 photometer 또는 spectrophotometer로 측정할 수 있는데 현탁액을 통과한 빛이 장치를 지나가면 굴절되지 않고 장치에 도달한 빛이 얼마나 되는 지 그 정도를 측정한다.  이 두 가지 장치의 주요 차이점은 photometer는 일반적으로 들어간 빛을 하나의 광범위한 일정 범위의 주파수의 전류만 통과시키는 장치를 사용하고, 이와 대조적으로 spectrophotometer는 좀 더 정확한 프리즘을 사용하거나 투사된 빛을 서로 다르게 끼워 넣는 것을 사용한다.  일반적으로 박테리아의 turbidity 측정에 널리 사용되는 wavelengths의 투사광은 540nm(녹색광), 600nm(오렌지광), 660nm(붉은색광) 이다.  이에 대해 언급하자면, spectrophotometers와 photometers 둘 다 굴절되지 않은 빛을 측정한다는 사실이다.  Cell의 수가 증가했을 때 일어나는 굴절되지 않은 빛의 감소는 photometer units에서 측정되거나(예를 들어, "Klett units(Klett-summerson photometer) spectrophotometer의 optical density(OD) unit에서 측정될 수 있다.

-Generating a standard curve

단일 cell organisms를 위해서, photometer 또는 OD는 cell의 수에 비례한다(확실한 한계점도 함께 존재한다.) .  Turbidity readings는 direct counting methods를 위해서 대신하여 사용할 수 있다.  그러나, 그 전에, standard curve가 먼저 준비되어야 하고, cell number의 direct 측정(현미경 또는 viable count 이용), 또는 turbidity에 의해서 주어지는 indirect measurment, 그리고 무게(dry weight)가 있어야 한다.  예를 들어, standard curve는 cell 숫자와 cell 무게 둘 모두의 자료를 이용해서 구성할 수 있고, 단일의 turbidity reading으로부터 두 parameter의 계산을 위해서 준비되어야 한다.
높은 cell 농도에서, 하나의 cell로부터 photocell을 거쳐서 투과 되어서 나온 빛은 다른 cell에 의해서 다시 되돌아서 튕겨 나갈 수 있다.  Photocell에서 이것이 만들어지면 이것은 마치 빛이 처음 장소에서 결코 투과되지 못한 것과 같은 상태가 된다.   높은 cell의 농도에서, cell의 숫자와 turbidity 사이의 일치는 그들의 linearity로부터 그들 스스로 흩어져 버리게 된다.  그럼에도 불구하고, 한계점에서, turbidity의 측정은 합리적으로 정확할 수 있고, 그들은 빠르고 쉽게 그들의 목적에 도달할 수 있는 효과가 있다.  Turbidity measurments는 sample을 파괴하거나 특이성 있게 흐트러뜨리지 않아도 측정할 수 있다.  이러한 이유 때문에, turbidity measurments는 미생물의 배양에서 growth 비율을 측정하기 위해서 널리 사용되고 있다.

3.  Continuous culture : The chemostat

Population growth 의 우리의 논의는 batch cultures에 한정해서 볼 수 있다.  Batch culture는 자라고 있는 개체의 대사 과정의 활성에 의해서 연속적으로 계조되고 그러므로 이것을 closed system이라고 한다.  처음에 배양을 시작할 때는 cell의 수는 최소이고, 영양분은 최대인 배지에서 cell이 계속 자라나므로 cell의 수가 최대가 되면 영양분은 최소가 된다.  Cell이 계속 자람에 따라서 배지의 환경이 계속 바뀌게 되어서 배지 내의 생리학적 상태 역시 계속 바뀌게 된다.  많은 연구를 위해서 긴 기간동안 끊임없는 환경의 culture가 유지되어야 한다.  예를 들어서 만약 particular enzyme의 합성과 같은 생태학적 생성 물질을 연구한다면, 지수배로 자라나는 cells의 효용도가 매우 유용할 것이다.  이러한 systems는 오직 연속적인 cultures에서만 가능하다.  연속적인 cultures는 신선한 배지의 volume이 끊임없이 유지 되는 open system이고 찌꺼기 culture  medium은 계속해서 밖으로 방출이 되므로 이 비율은 끊임없이 지속이 된다.  이러한 system은 계속해서 평형 상태를 유지하고, chemostat volume, cell의 수, 그리고 영양 상태 역시 계속적으로 평형 상태를 유지하여, 이러한 system을 steady state라고 한다.

-The chemostat

연속적인 culture device의 일반적 type은 chemostat이다.  Chemostat은 동시에 culture의 growth rate와 population density 둘 다를 통제한다.  Banch culture에서 영양성분의 농도는 culture의 growth rate와 growth yield 둘 모두에 영향을 미칠 수 있다.  주어진 영양 성분의 가장 낮은 농도에서, growth의 확률은 줄어들게 되고, 아마도 cell이 자라는 데 필요한 충분한 영양 성분들이 빠르게 cell 내로 공급되지 못하기 때문일 것이다.  중간 혹은 더 많은 영양 상태의 등급에서, growth rate는 cell yield가 연속적으로 증가하는 동안 별 영향을 미치지 않을 것이다.  즉, 희석을 조절해서(넣어주는 속도만 조절해 주면 됨)특이한 growth 확률을 조절 할 수 있는 것이다.
이와 대조적인 batch culture인, chemostat에서 growth rate와 growth yield는 각각의 서로 다른 것에 영향을 받지 않게 조절될 수 있고, 한계 정도의 영양 성분이 나타날 때의 농도에 의해서와 희석 비율에 의존하게 된다.
이들은 growth rate를 통제하는 희석 비율에서 넓은 한계점을 가지고 있으며, 비록 매우 낮은 그리고 매우 높은 희석 비율과 steady state가 동시에 나타나고 있다.  가장 높은 희석 점에서, 개체는 그들의 희석 농도에 의존해서 더 빠르게 자라날 수가 없고, culture는 chemostat에서 씻겨 나간다.  이와 대조적으로, 매우 낮은희석 농도에서는 cell의 큰 부분은 아마도 굶어서 죽게 될 것이다.  왜냐하면 한계점의 영양 성분은 cell의 대사 과정에 필요한 충분한 양이 빠르게 전달되지 않기 때문이다.  Chemostat에서 cell의 density(cells/milliliter)는 한계점의 영양 성분의 등급에 의해서 통제 되어진다.  Batch culture에서는 단지 cell yield만 측정이 가능하다.  만약 medium 내부의 영양분의 농도가 증가한다면, cell의 density 또한 증가할 것이다.  그러므로, 희석 비율과 영양 성분의 등급을 조정함으로써, 실험자는 dilute(예를 들어, 10의 5승배의 cells/ml), moderate(10의 7승배의 cells/ml), dense(10의 9승배의 cells/ml) population growing의 느리고, 중간 단계이고, 또는 매우 빠른 growth rate를 조절 할 수 있을 것이다.