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PCR
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<p>[[Polymerase Chain Reaction(PCR)]]</p>
<p>PCR의 원리 <br />
중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)은 특정 [[DNA ]] 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 방법이다. 적은 양의DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 [[제한효소]]의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다. 즉 genomic DNA와 같은 아주 큰 DNA로부터 원하는 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 agarose gel이나 polyacrylamide gel 상에서 뚜렷하게 보이는 band로 가시화할 수가 있다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 [[in vitro상에서 vitro]]상에서 특정 부위의 DNA를 105～108배까지 수 시간 내에 증폭시킬 수 있다, 이렇게 증폭된 DNA는 여러 실험에 이용하며, 실험 결과를 토대로 의학적인 연구에 응용할 수가 있다.<br />특히 PCR에 사용하는 DNA 중합효소인 [[Taq polymerase는 polymerase]]는 고온의 온천수(72-74℃)에서 서식하는 미생물에서 분리한 것으로 72℃에서 활성이 가장 높으며 95℃ 이상의 고온에서도 매우 안정하여 PCR을 자동화시키는데 결정적인 역할을 하게 되었다. <br />
PCR의 원리는 DNA의 양쪽 가닥을 주형으로 하여 원하는 DNA를 증폭시키는 방법으로 전체 DNA로부터 원하는 DNA 특정 부분을 선택적으로 증폭시.<br />
DNA polymerase가 DNA합성 시작을 위해서는 외가닥 DNA의 주형이 있어야 하므로, double stand(이중가닥)으로 되어있는 주형을 고온(95℃)에서 denaturation(변성)을 시켜야 한다.<br />
<p> 중합효소 연쇄반응은 다음의 세 단계로 이루어진다. <br />
<br />
1) DNA의 변성([[denaturation]]) <br />
90℃～96℃로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성도가 낮아질 수 있으므로 보통 94℃로 쓴다. Cycle의 처음은 확실한 변성을 위하여 약 5분간 시간을 주어야 한다. </p>
<p>2) Primer의 결합([[annealing]]) <br />
50℃～65℃에서 진행되며, 염기간에 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주어야 한다. 비특이 PCR 산물이 형성되는 경우 결합온도를 올려서 반응시켜 보면 비특이 산물을 줄이는데 도움이 되는 수가 있다. </p>
<p>3) DNA의 합성([[polymerization]]) <br />
70℃～74℃에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시키는 것이 좋다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000～4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어날 수 있다. Cycle이 계속되면서 효소 활성이 감소할 수 있고 DNA 산물은 점점 많이 존재하게 되므로 cycle 후반부에는 반응시간을 조금씩 늘려 가는 것도 좋은 방법의 하나이며, 마지막 cycle에는 시간을 충분히 (10분) 주어 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 한다. </p>
<p> 위 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25～35회) 원하는 DNA 부분을 증폭시키는 것이 중합효소 연쇄반응의 원리이다. </p>
- [[돌연변이]]분석, [[유전병]]진단, [[cDNA]] 합성 등에 이용에 쓰일 수 있다. <br />
- 세포로부터 한 특정 DNA 조각을 직접 클로닝하는데 쓰일 수 있다. <br />
- [[바이러스]]나 각종 병원균 검출 초기식별에 사용이 가능하다. <br /><br />
</p>