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<strong># PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점 <br /></strong><br /><strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">1. Template DNA<br /></font></strong><br />
선택하여 증폭하고자 하는 target DNA 단편을 가리키는 용어로서 세포내의 chromosomal DNA나 전염성 병우너체의 DNA 또는 RNA로부터 제조한 complementary DNA (cDNA), plasmid DNA 등을 쓸 수 있다. 불순물이 섞여 있으면 반응을 억제할 수 있으므로 가능한 한 정제하여 사용하는 것이 좋으며, 정제가 안된 경우에는 양이 적을 대 만응이 충분히 일어나지 않고 양이 많으면 비특이적 반응이 일어나므로 주의햐여 한다.<br />
Chromosomal DNA인 경우 1ug 이내, plasmid DNA의 경우 100pg~100ng 정도를 일반적으로 사용하지만 사용하고자 하는 DNA 내에 증폭하고자 하는 target DNA의 copy 수에 따라 달라질 수 있다. 전기영동상에서 비특이 DNA가 나타나거나 끌린 모양이 나타나면 맨 먼저 template DNA 양을 줄이는 것을 시도하는 것이 좋다.<br />
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<strong><br /><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">2. Primer</font></strong><br />
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Template DNA 가운데 선택적으로 증폭시키고자 하는 target DNA 단편의 양쪽 끝에서 안쪽으로 약 20bp 내외의 염기서열에 대응하는 pligonucleotide를 DNA 합성기로 합성하여 이용한다.<br />
Primer의 양은 0.1~0.5uM로 시행한다.<br />
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<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">3. dNTP (deoxynucleotide triphosphate)</font><br />
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시약상에서 dATP, dCTP, dGTP와 dTTP (각각 100mM stock)을 구입한 후 혼합하여 사용한다. 양은 target DNA의 길이에 따라 다를 수 있으나 각각 20~200 uM 정도를 사용한다.<br />
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<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00">4. 10x PCR 완충용액</font><br />
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1) Magenesium<br />
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A. Primer가 template DNA에 결합하는 능력<br />
B. Template 및 PCR 산물의 변성온도<br />
C. Product specificity<br />
D. dNTP와의 결합<br />
E. Taq polymerase의 활동성<br />
F. Primer-dimer artefact의 형성<br />
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a) 반응물 내에 EDTA와 같은 chelator가 포함되면 농도를 올려주어야 하고, dNTP나 template의 농도가 높으면 MgCl2의 농도를 높게 변화시켜야 한다.<br />
b) 위에 나열한 Mg의 기능중 A, B, C, D는 농도가 높을수록 실험에 유익하고 E, F는 농도가 낮을수록 실험에 유익하므로 최적 농도를 유지할 수 있도록 노력해야 한다.<br />
c) 반응이 잘 일어나지 않으면 0.5mM부터 2.5mM (때로는 8mM까지) 사이에서 농도를 변화시켜 가면서 최적조건을 찾도록 한다.<br />
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2) KCl<br />
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Primer가 target DNA에 결합하는 것을 도와주며, Taq DNA polymerase의 반응율을 높여준다.<br />
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3) Gelatin 또는 bovine serum albumin (BSA)<br />
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Taq DNA polymerase를 안정화한다.<br />
* 일부 보고에 의하면 반응완충용액 내에 KCl이나 gelatin, BSA 등을 첨가하지 않는 것이 더 좋다는 설도 있다.<br />
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<font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff00"><strong>5. Taq DNA polymerase</strong><br />
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Taq는 온천에서 사는 Thermus aquaticus 라는 균주에서 따온 이름이다. 이 균의 활동 적정온도는 70~74 도씨이며, 95도씨에서 40분이 지나도 50% 정도의 활성은 남아 있다. 이 효소가 발견되기 전에는 Klenow 효소를 이용하여 매 cycle마다 효소를 첨가해 주면서 반응을 시켜야만 했다.<br />
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DNA 합성의 오차율은 1.1*10의 -4 제곱 bp로 DNA polymerase I의 오차률 (1.0*10의 -5제곱) 보다 높은데 이는 Taq DNA polymerase가 잘못 들어간 nucleotide를 삭제하고 다시 합성하는 proofreading 기능 (3번 -> 5번 방향 exonuclease activity)이 없기 때문이다. 따라서 PCR 산물에서 유전자의 변이가 발견되더라도 반드시 확인 과정을 거쳐야 한다.<br />
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한 번의 반응에 사용하는 효소의 양은 보통 0.5~5 unit 정도인데 양이 너무 많으면 비특이적인 DNA가 형성될 가능성이 많고, 너무 적으면 증폭 산물이 부족하게 되므로 최적 조건을 찾도록 노력해야 한다.<br />
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</font></p>