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<span style="LINE-HEIGHT: 160%"><strong>Purification of DNA from living cells (살아있는 세포에서 DNA의 정제)</strong><br /><br />1. 전체 세포 DNA의 준비(Preparation of total cell DNA)<br />전반적인 순서는 아래와 같다<br />① 박테리아 컬처(bacteria culture)를 배양(grow)하고 수확(harvest)한다.<br />② cell을 깨뜨리고 열어 내용물(content)를 방출(release)시킨다.<br />③ 세포 내용추출물(cell extract)에서 DNA만 제외하고 모든 구성요소(component)를 제거한다.<br />④ DNA 용액(solution)을 농축(concentrated) 시킨다.<br /><br /><br />(1) 박테리아 컬처의 성장과 수확(Growing and harvesting a bacterial culture)<br />거의 모든 박테리아(bacteria)는 용액배지(liquid medium ; broth culture)에서 별 어려움 없이 잘 자란다.<br /><br />① culture medium (컬처배지)<br />culture medium은 박테리아(bacteria)가 자라고 효율적으로 세포분열(divide)되도록 필수 영양분(essential nutrient)의 농도가 알맞게 맞춰진(balanced) 혼합체(mixture)로 공급되어야 한다.<br />㈀ M9 : 정확한 정량적 배지(defined medium)<br />* 배지의 모든 구성물질(component)이 알려져 있다.<br />* 질소(nitrogen), 망간(magnesium), 칼슘(calcium) 같은 필수 요소(element) 제공의 무기영양소(inorganic nutrient)의 혼합체(mixture) 포함<br />* 글루코오스(glucose) : 탄소(carbon)과 에너지소스(energy source)<br />* 박테리아 생장(bacterial growth)을 위해 추적요소(trace element)나 비타민(vitamin) 같은 성장인자(growth factor)가 필요.<br /><br />㈁ Luria-Bertani (LB) : 구성요소가 확실하지 않은 배지(undefined medium)<br />그 구성요소(components)의 확실성(identity)와 정량(quantity)을 모른다.<br />* 트립톤(tryptone) : 아미노에시드(amino acid), 작은 펩타이드(small peptide)<br />* 이스트 추출물(yeast extract ; 부분적으로 분해(digest)된 yeast cell의 마른 준비물(dried preparation)) : 질소요구물(nitrogen requirement), 당(sugar), 무기영양소(inorganic), 유기영양소(organic nutrients)로 구성<br />→ 박테리아 생장(bacteria growth)를 위해 더 이상의 추가지원물질(supplementation)이 필요없다.<br /><br />② 간단한 DNA 소스(simple DNA source)를 얻기 위한 컬쳐(culture)<br />→ 혼합배지(complex medium ; LB)가 적당<br />* LB medium에서 37˚C 회전 배양기(rotary platform)에서 150 ~ 250 rpm으로 섞는다(shaking)<br />→ 대장균 세포(E.coli cell)은 20분마다 한번씩 분열, 약 2 ~ 3 x 10^9 cells/ml의 최대밀도(maxium density)에 도달할때까지 자란다.<br />* 컬쳐(culture)의 성장(growth) 측정은 600 nm의 가시밀도(optical density)를 측정해서 안다.<br />→ 600 nm wave length(파장길이)에서 1OD unit(optical density unit)은 0.8 x 10^9 cells/ml 이다.<br />* 세포 추출물(cell extract)의 준비<br />박테리아(bacteria)는 가능한 작은 부피(small volume)로 취하고 수확(harvesting)은 컬쳐(culture)를 원심분리(centrifuge)해서 준비한다.<br />→ 원심분리(centrifugation)의 속도를 적당히 낮추면 박테리아 침전물(bacteria pellet)의 튜브(tube) 아래에 위치하고 상층물(supertanent)에 위치한 컬쳐배지(cuture media)는 따라서 버린다.<br /><br />(2) 세포 추출물의 준비(Preparation of a cell extract)<br />박테리아 세포(bacterial cell)은 세포질막(cytoplasmic membrane)에 들어있고 딱딱한 세포벽(rigid cell wall)에 의해 둘러쌓여 있다.<br />ex) 대장균(E,coli)은 세포벽(cell wall) 다음에 2차로 외부막(outer membrane)이 있다.<br /><br />* 박테리아 세포(bacterial cell)를 깨는 방법<br />㉠ physical method(물리적 방법) : mechanical force(기계적 힘)로 cell을 깬다<br />㉡ chemical method(화학적 방법) : cell barrier(세포 벽이나 막 같은 것)에 영향을 주는 chemical agent(화학적 인자)에 노출하여 cell을 lysis(용해)한다.<br />→ DNA preparation(DNA 프리퍼레이션)에 많이 쓰임<br /><br />* Chemical method(화학적 방법)<br />chemical lysis(화학적 분해)<br />㉠ 세포벽(cell wall)을 공격하는 인자(agent)<br />㉡ 세포막(cell membrane)을 깨는 인자(agent)<br />ex) 대장균(E.coli)<br />** cell wall<br />lysozyme(라이소자임) : cell wall rigidity(딱딱한 세포벽)를 유지시키는 polymeric compound(폴리머 구성요소)를 digest(분해)한다.<br />ethylenediamine tetraacetate(EDTA) : cell envelope(세포를 둘러싸는) 전체 structure를 유지하는 필수 magnesium을 제거한다. DNA를 degrade(분해)하는 cellular enzyme(세포 효소)을 inhibit(방해)한다.<br />** detergent(세제) : sodium dodecyl sulphate (SDS)<br />lipid molecule(지방 세포의 일종)의 제거로 lysis(분해) 과정을 돕고 cell membrane(세포막)의 파괴를 이끈다.<br /><br />* insoluble cell debris(녹지않는 세포의 찌꺼기)의 제거<br />부분적으로 digest(분해)된 cell wall fraction(세포벽 조각) 같은 compound는 centrifugation(원심분리)에 의해 pelleted(뭉쳐서 아래에 쌓임)된다.<br />그러면 비교적 clear supernatant(맑은 상액층) 같은 cell extract(세포 추출물)가 남는다.<br /><br />(3) Purification of DNA from a cell extract (세포 추출물에서 DNA의 정제)<br />bacterial cell extract에는 protein, RNA, DNA가 들어있다.<br />① cell extract의 deproteinize(단백질 분해)<br />phenol과 chloroform의 1:1 mixture를 첨가한다.<br />→ nucleic acid(DNA,RNA)를 수용성 액(aqueous solution)에 남기고 단백질(protein)만 가라 앉힌다.<br /><br />* 방법<br />cell extract를 용매(solvent)와 부드럽게 섞임(gently mix)하고 원심분리(centrifugation)에 의해 레이어(layer)로 나뉘어진다.<br />침전된 단백질 분자(precipitated protein molecule)이 수용액(aqueous)과 유기물 레이어(organic layer) 사이에 하얀 실타레처럼 엉킨 덩어리(coagulated mass)로 남는다.<br />→ 핵산(nucleic acid)의 수용액(aqueous solution)은 파이펫(pipette)로 옮긴다.<br />만약 단백질 구성물(protein content)이 너무 크면 단순 페놀 추출(single phenol extraction)은 핵산(nucleic acid)으로 완벽히 정제(purify)하기엔 충분치 않다.<br />→ 페놀추출(phenol extraction)시 섞임(mixing)과 원심분리 단계(centrifugation step)는 DNA molecule의 손상을 가져올 수 있어 반복사용이 어렵다.<br />∴ 페놀 추출법(phenol extraction) 전에 프로테인에이즈 케이(proteinase K) 나 프로네이즈(pronase)같은 프로티이즈(protease ; 단백질 분해제)를 세포추출물(cell extract)에 처리한다.<br />→ 폴리펩타이드(polypeptide ; 단백질 구성요소)를 작은 unit으로 잘라 페놀(phenol)에 의해 쉽게 제거되게 한다.<br />** RNA에서 mRNA는 페놀처리(phenol treatment)로 제거가 되나 그 외의 RNA는 aqueous layer에 남게된다.<br />→ 라이보뉴클리에이즈 효소(ribonuclease enzyme ; RNA 분해제)를 써서 ㄹ이보뉴클레오타이드 구성요소(ribonucleotide subunit)로 degrade(분해) 시킨다.<br /><br /><br />(4) Concentration of DNA sample (DNA 샘플의 농축)<br />dilute solution(농도가 낮은 용액)이 종종 얻어지므로 DNA 농도를 증가시키는 것은 중요하다.<br />* Ethanol precipitation(에탄올 침전) 방법<br />salt(sodium ion Na+ 같은 monovalent cation 상태 ; 전자 1가인 상태)의 존재하에 온도(temperature) -20˚C 이하는 absoulte ethanol은 효과적으로 polymeric acid를 침전시킨다.<br />유리막대(glass pod)이나 원심분리(centrifugation)으로 DNA molecule을 구함<br />에탄올침전법(Ethanol precipitation)은 short-chain과 monomeric nucleic acid component를 solution에 남기므로 이때 robonuclease treatment에 의해 ribonucleotide(RNA)가 없어진다.<br /><br /><br />(5) Measurement of DNA concentration (DNA 농도의 측정)<br />Ultraviolet(UV) absorbance spectrophotometry(방사선 흡수 측정기)에 의해 DNA 농도가 측정가능하다.<br />→ DNA solution에 의해 흡수된 UV radiation(방사선)의 양은 sample의 DNA 양에 비례한다.<br />wavelength(파장) 260nm에서의 absorbance(흡수도) A260의 1은 ml당 double stranded DNA의 50㎕에 해당한다.<br />∴ A260 1 = 50㎕/ml<br />* DNA preparation의 purify 측정<br />A260/A280 < 1.8<br />→ DNA가 protein이나 phenol에 의해 오염되었음을 암시한다.<br /><br />(6) Preparation of total cell DNA from organisms other than bacteria (박테리아가 아닌 다른 생물에서의 전체 세포 DNA의 정제)<br />사용되는 cell의 특별한 성질에 따라 좀 modification이 된 방법이 필요하다.<br />① Cell breakage stage(세포를 깨는 단계)에 의한 수정 필요<br />chemical이 cell의 종류에 따라 기능의 차이가 있다.<br />② DNA에서 cell의 extracted biochemical(생화학적) content(내용물)에 의한 수정 필요<br />ex) most bacteria<br />cell extract → DNA(leave pure DNA sample), RNA(ribonuclease 처리하여 없앰), protein(phenol extraction, protease treatment에 의한 제거)<br />그러나, plant tissue에서는 상황이 다르다.<br />많은 양의 biochemical(carbohydrate) 때문에 phenol extraction에 의한 제거 효율이 저하된다.<br />그러므로 아래와 같은 방법을 추가한 수정이 필요하다.<br /><br />㉠ Cetyltrimethylammonium(CTAB) detergent 사용 → nucleic acid와 insoluble complex 형성.<br />∴ plant cell extract에 CTAB를 첨가하면, CTAB-nucleic acid complex가 침전되고 carbohydrate, protein, 다른 contaminant(오염물질)는 supernatant(상액층)에 남는다.<br />precipitate(침전물)는 centrifugation(원심분리)으로 모으고 1M NaCl로 resuspend하고 complex를 깬다.<br />Ribonuclease treatment로 RNA를 제거하여 pure plant DNA를 얻는다.<br /><br /><br />㉡ Guanidinium thiocyanate compound를 포함한 방법<br />guanidinium thiocyanate는 nucleic acid를 제외한 모든 biochemical을 denature하고 dissolve한다. 그러므로 어떤 tissue type이라도 DNA release가 가능하다.<br />guanidinium thiocyanate 존재하에 DNA는 silica particle에 tight하게 bind한다.<br />→ biochemical의 denatured mix에서 chromatography column을 통해 DNA를 쉽게 얻을 수 있다. column의 silica particle + DNA complex는 늦게 내려오고 그 외는 빨리 내려오는 것을 이용하여 얻은 다음, 물을 첨가하여 DNA와 silica와 interaction을 깨서 DNA를 얻는다.</span>