DNA정제(purification)

Purification of DNA from living cells (살아있는 세포 DNA의 정제)

1. 전체 세포 DNA의 준비(Preparation of total cell DNA)

① 박테리아 컬처(bacteria culture)를 배양(grow)하고 수확(harvest).
② cell을 깨뜨리고 열어 내용물(content)를 방출(release).
③ 세포 내용추출물(cell extract)에서 DNA만 제외하고 모든 구성요소(component)를 제거.
④ DNA 용액(solution)을 농축(concentrated) .


(1) 박테리아 컬처의 성장과 수확(Growing and harvesting a bacterial culture)


① culture medium
culture medium은 박테리아가 자라고 효율적으로 세포분열(divide)되도록 필수 영양분(essential nutrient)의 농도가 알맞게 맞춰진(balanced) 혼합체(mixture)로 공급해야함.
㈀ M9 : 정량적 배지(defined medium)
* 배지의 모든 구성물질(component)이 알려짐.
* 질소(nitrogen), 망간(magnesium), 칼슘(calcium) 같은 필수 요소(element) 제공 무기영양소(inorganic nutrient)의 혼합체(mixture) 포함
* 글루코오스(glucose) : 탄소(carbon)과 에너지(energy source)
* 박테리아 생장(bacterial growth)을 위해 추적요소(trace element)나 비타민(vitamin) 같은 성장인자(growth factor)가 필요함.

㈁ Luria-Bertani (LB) : 구성요소가 확실치 않은 배지(undefined medium)
* 트립톤(tryptone) : 아미노에시드(amino acid),
* 이스트 추출물(yeast extract ; 부분적으로 분해된 yeast cell의 마른 준비물(dried preparation)) : 질소요구물(nitrogen requirement), 당(sugar), 무기영양소(inorganic), 유기영양소(organic nutrients)로 구성됨
→ 박테리아 생장(bacteria growth)를 위해 더 이상의 추가지원물질(supplementation)이 필요없다.

② 간단한 DNA 소스(simple DNA source)를 얻기 위한 컬쳐(culture)
→ 혼합배지(complex medium ; LB) 적당
* LB medium에서 37˚C 회전 배양기(rotary platform)에서 150 ~ 250 rpm으로 섞음(shaking)
→ 대장균 세포(E.coli cell)은 20분마다 한번씩 분열, 약 2 ~ 3 x 10^9 cells/ml의 최대밀도(maxium density)에 도달할때까지 자람.
* 컬쳐(culture)의 성장(growth) 측정은 600 nm의 가시밀도(optical density)를 측정.
→ 600 nm wave length(파장길이)에서 1OD unit(optical density unit)은 0.8 x 10^9 cells/ml 임.
* 세포 추출물(cell extract)의 준비
박테리아(bacteria)는 가능한 작은 부피(small volume)로 취하고 수확(harvesting)은 컬쳐(culture)를 원심분리(centrifuge)해서 준비.
→ 원심분리(centrifugation)의 속도를 적당히 낮추면 박테리아 침전물(bacteria pellet)의 튜브(tube) 아래에 위치하고 상층물(supertanent)에 위치한 컬쳐배지(cuture media)는 따라 버린다.

(2) 세포 추출물의 준비(Preparation of a cell extract)
박테리아 세포(bacterial cell)은 세포질막(cytoplasmic membrane)에 들어있고 딱딱한 세포벽(rigid cell wall)에 의해 둘러쌓임.
ex) 대장균(E,coli)은 세포벽(cell wall) 다음에 2차로 외부막(outer membrane)이 있다.

* 박테리아 세포(bacterial cell)를 깨는 방법
㉠ physical method(물리적 방법) : mechanical force(기계적 힘)로 깨는 경우와
㉡ chemical method(화학적 방법) : cell barrier(세포 벽이나 막 같은 것)에 영향을 주는 chemical agent(화학적 인자)에 노출하여 cell을 lysis를 한다.
→ DNA preparation(DNA 프리퍼레이션)에 많이 쓰임

* Chemical method(화학적 방법)
chemical lysis(화학적 분해)
㉠ 세포벽(cell wall)을 공격하는 인자(agent)를 사용하거나
㉡ 세포막(cell membrane)을 깨는 인자(agent)를 쓴다.
ex) 대장균(E.coli)
** cell wall
lysozyme(라이소자임) : cell wall rigidity(딱딱한 세포벽)를 유지시키는 polymeric compound(폴리머 구성요소)를 digest(분해)시킨다.
ethylenediamine tetraacetate(EDTA) : cell envelope(세포를 둘러싼) 전체 structure를 유지하는 필수 magnesium을 제거한다. DNA를 degrade(분해)하는 cellular enzyme(세포 효소)을 inhibit(방해)한다.
** detergent(세제) : sodium dodecyl sulphate (SDS)
lipid molecule(지방 세포의 일종)의 제거로 lysis(분해) 과정을 돕고 cell membrane(세포막)의 파괴를 이끌어낸다.

* insoluble cell debris(녹지않는 세포의 찌꺼기)를 제거시킨다.
부분적으로 digest(분해)된 cell wall fraction(세포벽 조각) 같은 compound는 centrifugation(원심분리)에 의해 pelleted(뭉쳐서 아래에 쌓임)이 된다.
그러면 비교적 clear supernatant(맑은 상액층) 같은 cell extract(세포 추출물)가 남게된다.

(3) Purification of DNA from a cell extract (세포 추출물에서 DNA의 정제)
bacterial cell extract에는 protein, RNA, DNA등이 들어있다.
① cell extract의 deproteinize(단백질 분해)
phenol과 chloroform의 1:1 mixture를 첨가를 한다.
→ nucleic acid(DNA,RNA)를 수용성 액(aqueous solution)에 남기고 단백질(protein)만 가라 앉게 된다.

* 방법
cell extract를 용매(solvent)와 부드럽게 섞임(gently mix)하고 원심분리(centrifugation)에 의해 레이어(layer)로 나뉘어지게 된다.
침전된 단백질 분자(precipitated protein molecule)이 수용액(aqueous)과 유기물 레이어(organic layer) 사이에 하얀 실타레처럼 엉킨 덩어리(coagulated mass)로 남게된다.
→ 핵산(nucleic acid)의 수용액(aqueous solution)은 파이펫(pipette)로 옮긴다.
만약 단백질 구성물(protein content)이 너무 크면 단순 페놀 추출(single phenol extraction)은 핵산(nucleic acid)으로 완벽히 정제(purify)하기엔 충분치 않게 된다.
→ 페놀추출(phenol extraction)시 섞임(mixing)과 원심분리 단계(centrifugation step)는 DNA molecule의 손상을 가져올 수 있어 반복사용은 하지 않는다.
∴ 페놀 추출법(phenol extraction) 전에 프로테인에이즈 케이(proteinase K) 나 프로네이즈(pronase)같은 프로티이즈(protease ; 단백질 분해제)를 세포추출물(cell extract)에 처리할 수 있다.
→ 폴리펩타이드(polypeptide ; 단백질 구성요소)를 작은 unit으로 잘라 페놀(phenol)에 의해 쉽게 제거되게 할 수 있다.
** RNA에서 mRNA는 페놀처리(phenol treatment)로 제거가 되나 그 외의 RNA는 aqueous layer에 남게 할 수 있다.
→ 라이보뉴클리에이즈 효소(ribonuclease enzyme ; RNA 분해제)를 써서 리보뉴클레오타이드 구성요소(ribonucleotide subunit)로 degrade(분해) 시킨다.


(4) Concentration of DNA sample (DNA 샘플의 농축)
dilute solution(농도가 낮은 용액)이 종종 얻어지므로 DNA 농도를 증가시키는 것은 중요과정이다.
* Ethanol precipitation(에탄올 침전) 방법
salt(sodium ion Na+ 같은 monovalent cation 상태 ; 전자 1가인 상태)의 존재하에 온도(temperature) -20˚C 이하는 absoulte ethanol은 효과적으로 polymeric acid를 침전시킬 수 있다.
유리막대(glass pod)이나 원심분리(centrifugation)으로 DNA molecule을 구함
에탄올침전법(Ethanol precipitation)은 short-chain과 monomeric nucleic acid component를 solution에 남기므로 이때 robonuclease treatment에 의해 ribonucleotide(RNA)가 없어질 수 있다.


(5) Measurement of DNA concentration (DNA 농도의 측정)
Ultraviolet(UV) absorbance spectrophotometry(방사선 흡수 측정기)에 의해 DNA 농도가 측정가능하다.
→ DNA solution에 의해 흡수된 UV radiation(방사선)의 양은 sample의 DNA 양에 비례함.
wavelength(파장) 260nm에서의 absorbance(흡수도) A260의 1은 ml당 double stranded DNA의 50㎕에 해당.
∴ A260 1 = 50㎕/ml
* DNA preparation의 purify 측정
A260/A280 < 1.8
→ DNA가 protein이나 phenol에 의해 오염되었음을 시사한다.

(6) Preparation of total cell DNA from organisms other than bacteria (박테리아가 아닌 다른 생물에서의 전체 세포 DNA의 정제)
사용되는 cell의 특별한 성질에 따라 약간의 modification이 된 방법이 필요하다.
① Cell breakage stage(세포를 깨는 단계)에 의한 수정 필요하다.
chemical이 cell의 종류에 따라 기능의 차이가 있음.
② DNA에서 cell의 extracted biochemical(생화학적) content(내용물)에 의한 수정 필요하다.
ex) most bacteria
cell extract → DNA(leave pure DNA sample), RNA(ribonuclease 처리하여 없앰), protein(phenol extraction, protease treatment에 의한 제거)
그러나, plant tissue에서는 상황이 다를 수 있다.
많은 양의 biochemical(carbohydrate) 때문에 phenol extraction에 의한 제거 효율이 저하되기 떄문에 아래와 같은 방법을 추가한 수정이 필요하다.

㉠ Cetyltrimethylammonium(CTAB) detergent 사용 → nucleic acid와 insoluble complex 형성을 시킴.
∴ plant cell extract에 CTAB를 첨가하면, CTAB-nucleic acid complex가 침전되고 carbohydrate, proin, 다른 contaminant(오염물질)는 supernatant(상액층)에 남는다.
precipitate(침전물)는 centrifugation(원심분리)으로 모으고 1M NaCl로 resuspend하고 complex를 깨버린다.
Ribonuclease treatment로 RNA를 제거하여 pure plant DNA를 얻을 수 있다.


㉡ Guanidinium thiocyanate compound를 포함한 방법과정
guanidinium thiocyanate는 nucleic acid를 제외한 모든 biochemical을 denature하고 dissolve하기 떄문에 tissue type이라도 DNA release가 가능하다.
guanidinium thiocyanate 존재하에 DNA는 silica particle에 tight하게 bind할 수 있다.
→ biochemical의 denatured mix에서  chromatography column을 통해 DNA를 얻기 쉽다. column의 silica particle + DNA complex는 늦게 내려오고 그 외는 빨리 내려오는 것을 이용하여 얻은 후에 물을 첨가하여 DNA와 silica와 interaction을 깨서 DNA를 얻는다.