분리 정제법

1. 정제의 조립 방법

1-1. 정제를 시작하기 전
단백질은 변성, 분해 및 흡착 등에 의해서 실활되거나 소실된다. 따라서, 단백질의 정제는 이러한 손실을 피하고, 가능한 한 짧은 시간에 효율 좋은 일련의 방법이 이루어져야 한다. 단백질 정제를 효율좋게 행하기 위해서 특히 중요한 것부터 이하에 기술하고자 한다.

1) 활성 측정
목적 단백질의 존재량을 가능한 한 정확하고 간편하게 검정할 수 있는 방법을 가지고 있는 것이 매우 중요하다. 검정시간이 길어지게 되면 정제기간이 길어질 뿐 아니라 정제 자체도 곤란하게 되어진다.

목적	정제 단백질
N말단 아미노산 배열의 분석	10 ~ 50 pmol
분자내 아미노산 배열의 분석	100 ~ 500 pmol
아미노산 조성분	약 100 pmol
분자량 (질량분석)	0.1 ~ 10 pmol
생리 기능의 해석	0.01 ~ 1mg
항체 제작	0.1 ~ 10 mg
고차 구조의 해석	10 ~ 100mg

표. 단백질 정제를 위한 용량 

• 분석 능력이 높은 기기를 사용한 경우
  
  • 분자량이 수만 이하의 단백질
    

2) 정제의 목표
실험의 목적에 의해서 정제법의 조립방법이 크게 달라진다. 표에 여러 가지의 실험 목적에 따라 필요한 단백질량의 예를 나타냈었다. 예를 들면, 클로닝을 위한 일차구조 (아미노산 배열)의 분석을 하고자 할 경우 정제된 단백질은 변성되어 있어도 무방하다. 분석 능력이 높은 자동 아미노산 배열 분석장치 (protein sequencer) 를 사용하는 경우 10 pmol (분자량 1만의 단백질로서 0.1 ug) 로서 최고 수십 개의 N 말단 아미노산 배열 결정이 가능하다. 최종적으로 정제되는 표준폼은 여분을 두어 2 ~ 3 배의 정제가 필요하다. N 말단 아미노산이 블록되어 있으면 N 말단 배열 분석이 어렵다. 이 경우 정제 단백질을 제한 분해하고 내부의 배열을 보고자 할 경우에는 또 다시 그 수배의 정제가 요구된다.

좋은 DNA probe를 합성하기 위하여서는 가능한 한 많은 아미노산 배열을 가지고 있는 것이 중요하다. 최근, 단백질용의 질량분석 장치의 개량이 눈부시게 발전되어 있고, 단백질이나 펩티드의 일차구조해석의 정밀도나 미량화가 보다 진전되어 있다. 한편, 생리활성의 해석을 위하여서는 당연히 미변성의 상채로 통상 수십 ug이상의 단백질이 필요하다. 그리고, 입체구조의 해석을 위하여서는 수십 mg 이상의 미변성 단백질, 항체제작을 위하여서는 통상 수백 ug 정도의 미변성 또는 변성 단백질이 필요하게 된다.

3) 양질 대료 확보
목적단백질의 절대 함량과 상대 함량 (또는 비활성 : 전체의 단백질량에 대한 목적 단백질의 활성) 이 높은 재료를 선별한다. 정제에 있어서 단백질의 회수율은 수 %부터 수십 %의 범위가 대부분이다. 출발재료가 불충분하면, 정제하는 도중에 목적 단백질이 없어지게 되며, 재료의 제조부터 다시 출발하여야만 한다. 이러한 것을 피하지 않으면, 언제나 목적 단백질의 정제는 불가능하다. 처음부터 출발재료에 존재하는 목적 단백질의 양을 예측하고, 충분한 분량을 확보하여야만 한다. 매우 대략적인 측정으로서 cytokine 이나 효소는 수 ng이거나 수십  ng 정도에서 활성 검출이 가능하며, 특별히 높은 비활성을 가진 것은 수십 pg에서도 검출이 가능하다. 비활성 1단위/ng의 단백질을 10%의 수율로서 10ug 을 얻기 위하여서는 출발 재료에 최저 1*10의 5제곱 단위의 활성이 존재하고 있을 필요성이 있다.

4) 단백질의 안정화