면역 염색법
면억조직 (세포) 염색법은 항우너항체 반응을 이용하고 조직이나 세포중의 항원의 존재하는 부위를 특이적으로 검출하는 방법이다. 좋은 항체를 사용하면, 목적의 항원의 분포를 명확하게 하고, 그러면 감도가 좋아진다. 한편, 이러한 방법은 어떠한 항원 물질의 검출에도 이용되지는 않는다. 이러한 방법이 유용한 것은 작제한 표본에 있어서 목적하는 물질이 충분한 항원성을 가지고, 충분량의 존재하에서 가능하다. 면역 염색법에서는, 조직이나 세포의 고정, 절편 작제, 염색의 각 과정에서 다양한 방법이 사용되어지고 있다. 최적의 결과를 얻기 위하여서는 이러한 방법으로부터 선책하는 것이다. 여기서는 염색 결과를 좌우하는 중요한 실험 조건에 관하여 설명하고, 일반적으로 실험실에서 행하여지는 방법, 조직과 세포의 염색을 위한 대표적인 조작을 표시한다.
1. 중요한 실험조건
1) 검출법의 선택
면역 염색법은 Western blotting법과 같이 특이 항체를 적당한 marker로 표식하고, 항원을 검출하는 방법이다. Marker의 종류에 따라 효소 항체법, 형광 항체법, golr 코로이드 항체법 등이 있다. 효소 항체법에서는 불용성의 착색 물질을 생산하고, 서양 horseradish peroxidase (HRP) 나 alkaline phosphatase (ALP) 등이 있으며, 또한 형광 항체법에서는 fluorescein isothiocynate (FITC) 가 대표적인 marker로서 사용되고 있다. HRP의 기질로서는 녹색을 띠며, 3,3'-diaminobenzidine (DAB)나 적색을 나타나는 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) 가, 그리고 ALP의 기질로서는 짙은 청색을 나타내는 Nitroblue tetrazolium (NBT) 등이 사용되어지고 있다. 형광 항체법은 형광색소를 항체의 marker로서 사용하는 방법이다. 형광 현미경이 필요하지만 선명한 염색상은 설득성이 있고 미량의 항원의 검출에 유용하다. 한편 비교적 단시간에 퇴색하기 때문에 그전에 기록하여 둘 필요가 있다.
표식방법에 관하여 marker를 특이항체에 직접 표시하는 직접 표시법과 특이항체 (일차 항체) 에 대한 항체 (이차 항체 : 예를 들면 항마우스 IgG 항체) 에 표식하는 간접 표식법이 있다. 직접 표식법은 항원항체 반응이 1회에 한정하기 때문에 조작의 간격시간이 짧고, 비특이적인 염색도 적게 나타난다. 반면, 각종 항체에 효소를 표식하는 한편, 그리고 표식 반응에 의해서 항체가 활성이 낮아지는 경우도 적다. 간적 표식법은 일차 항체를 작제한 동물종에 대한 표식 이차 항체를 사용하기 위하여서는 시판되어지는 제품이 있다. 반응이 증강되어 강한 염색상이 관찰되어진다. 한편, 작업 간격과 시간이 걸리며 비특이적인 반응이 나타나기 쉽다. 항원의 검출 감도를 높이기 위하여 아주 다양한 간접 효소 항체법이 고안되어 있다. 그러한 대표적인 예로서는 AB법과 PAP법이 있다.
