Immunohistichemistry (면역염색)
- 특이적인 항체(antibody, 이하 Ab)로 세포, 조직 내의 target 항원(antigen, 이하 Ag)의 위치와 분포 동정이 목적
- Ab는 형광물질(fluorescent), colorimetric label이 붙어 있어, label 위치로 target Ag의 위치를 파악할 수 있는 것임.
Protocol 1
1. 목적 : cytokine을 monoclonal Ab (단일클론항체)를 이용하여 indirect staning!!
ex) IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-r, TNF-α
2. 재료 및 장비
- Frozen sections (동결절편) of sample tissues
- Glass slides
- Cover slips
- 4% paraformaldehyde, pH 7.4
- Tris-buffered Saline, 0.1% Saponin, pH 7.4
- Tris-buffered Saline/ 0.3% H2O2/ 0.1% Saponin, 0.02% NaN3
- 1% Goat Serum in TBS/ Saponin
- Refrigerator (4도)
- Primary Ab
- Secondary Ab
- Diaminobenzidine tetrachloride
- Hematoxylin
- Ethanol
- Microscope
3. Procedure
1) 실온에서 2시간 동안 동결조직 절편 (8um thickness)을 말린다.
2) 실온에서 절편을 4% paraformaldehyde로 15분간 고정시킨다. (Fixation)
3) TBS/ 0.1% Saponin으로 slide를 각각 5분씩 washing (2번 * 5분)
4) TBS/ H2O2/ Saponin/ NaN3에 30분간 incubation, endogenous peroxidase block
5) TBS/ Saponin으로 slide washing (3번 * 3분)
6) TBS/ Saponin으로 1/100으로 희석시킨 goat serum을 20분간 처리하여, non-specific한 binding site를 block
7) Ab로 4도씨에서 overnight incubation
8) TBS/ Saponin으로 slide washing (4번), biotin이 붙은 secondary Ab(이하 2nd Ab)로 30분간 slide와 incubation
9) Avidin-biotin-peroxidase를 첨가한 후, distilled water(증류수, 이하 D.W)에 희석시킨 0.5mg/ml DAB solution으로 slide를 incubation시킨다. 그러면 Ag-primary Ab의 정도가 갈색 침전 (precipitate)이 생기게 되어, 이것으로 peroxidase activity를 측정한다.
10) TBS로 slide washing (4번)
11) Hematoxylin으로 1분간 counterstaining (착색)
12) 75% -> 80% -> 100% ethanol 순서로 각각 1분씩 slide를 dehydration
13) Slide sealing
14) Optical microscope로 분석
Protocol 2
1. 목적 :
- Intracellular phosphate residue의 indirect staining. Phosphorylation (인산화) state-specific Ab는 1) 단백질 내의 특정 residue가 인산화되었는지 확인하는데 유용하게 사용된다. 2) 인산화된 단백질의 세포내 위치 (subcellular localization) 결정한다
- 단백질의 인산화는 단백질을 세포 내의 새로운 장소로 가게 한다.
ex) membrane, focal adhesion, nucleus 등
2. 재료 및 장비
- Sample cells/ Stimulant
- Glass slides and cover slips
- PBS
- 3.7% & 10% formaldehyde in PBS
- 10% paraformaldehyde
- 0.2% Triton X-100
- Methanol
- 0.06% Triton X-100/ PBS
- 30% H2O2
- 1% BSA
- Primary Ab
- Secondary Ab
- GelMount
- Fluorescent microscope
- Goat serum
3. Protocol A : Used with prostate (전립선의) epithelial cells
1) Cell들을 glass cover slip에 놓고, 붙을 수 있도록 overnight 배양한다.
2) PBS로 1번 헹구어 준다. (rinse)
3) Formaldehyde/ PBS로 15분간 cell들을 고정시킨다. (fixation)
4) PBS로 1번 washing
5) Triton X-100을 2분간 처리
6) 1X PBS로 washing
7) PBS로 희석시킨 1st Ab로 최소 1시간 incubation
8) PBS washing (5분 * 3번)
9) PBS로 희석시킨 2nd Ab (goat anti-rabbit Ig'g FTTC)로 1시간 incubation
10) PBS washing (5분 *3번)
11) Gelmount를 이용하여 slide위에 각각의 cover slip을 mount
12) Fluorescence microscope로 분석
3-1. Protocol B : Used with NIH3T3 and FIII cells
1) Serum-free 배지에 24시간 incubation -> starve cells
2) 적당한 자극으로 cell들을 stimulation
3) 10% paraformaldehyde (in PBS)로 15분간 cell들을 고정 (fixation)
4) PBS로 3번 rinse
5) 100ml PBS에 있는 30% peroxide 1ml로 30분 incubation (peroxidase block)
6) 100% methanol로 -20도씨에서 10분간 incubation시켜 cell을 permeabilize
7) PBS로 cell rinse 3번
8) 1% BSA로 30~60분 block
9) PBS로 cell rinse 3번
10) PBS (5% goat serum + 0.25% NP40)에 들어 있는 1st polyclonal Ab (300ng/ml~1ug/ml)로 incubation
11) PBS로 3번 washing
12) 2nd Ab (at 1:2000 in 2% goat serum in PBS, ex. goat anti-rabbit Ig's)로 incubation
13) PBS로 3번 washing
14) Conjugate vector ABC kit으로 30분. 각각의 reagent (in PBS)를 20ug/ml로 희석
15) ABC reagent 첨가 (60분)
16) PBS로 3번 washing
17) DAB substrate 첨가 (각각 1ml 당 one tablet)
3-2. Protocol C : Used with Rat52, Swiss 3T3, NIH3T3 and HEK293 cells
1) 10% paraformaldehyde로 RT(실온)에서 15분간 cell 고정 (fixation)
2) 100% methanol로 -20도씨에서 10분간 permeabilization
3) 1% BSA로 block
4) 1st polyclonal Ab (at 300ng/ml)로 1시간 incubation
5) Washing & fluorescein-labeled 2nd, goat anti-rabbit Ig's FITC 첨가
3-3. Protocol D : Used with Rat Brain Slices (30um floating rat brain sections)
1) PBS로 5분씩 3번 washing
2) Triton X-100/ PBS (0.06%)로 30분간 permeabilization
3) PBS 5분 * 3번 washing
4) PBS에 들은 3% normal serum으로 30분간 blocking (2nd Ab가 goat Ab면 goat serum)
5) PBS에 들은 3% normal serum에 희석시킨 1st Ab로 4도씨에서 overnight incubation
6) PBS 5분 * 3번 washing
7) PBS에 희석시킨 2nd Ab (1:500~1:1000)으로 1시간 incubation
8) PBS 5분 *3번 washing
9) Fluorescent 2nd Ab의 경우, vectashield (+DAPI if nuclear marker is desired)
HRP-conjugated 2nd Ab or biotin-streptavidin-HRP의 경우, substrate 첨가
10) Develop until color is visible (~10분), 100% glycerol 또는 FluormountG로 mounting