Buffer 조제법
1. Buffer (완충액)의 선택
단백질을 용액상태에서 취급할 때에는 통상 어떤 buffer (수소 이온 buffer)를 사용하게 된다. 단백질 용액의 pH를 조절하는 목적은 단백질의 안정화, 효소 등의 활성 측정, 각종 크로마토그래피의 조건 설정 등 여러 가지가 있으므로 목적에 맞추어 buffer를 선택할 필요가 있다. 그러나 빈번하게 사용되고 있는 buffer의 종류는 한정되어 있어 몇 종류의 완충제로서 대부분의 실험에 대응하고 있다.
Buffer를 선택할 때에는 사용하는 pH가 가장 중요한 조건이 된다. 완충제가 가지고 있는 완충능력은 pKa(해리정수의 역대수)가 최대로 되며 여기서부터 벌어지는 정도에 따라 낮아지게 되기 때문에 사용하는 pH에 따라 완충제의 종류는 제한된다. 일반적으로 pKa ±0.5 정도의 pH 범위에서 유효한 완충 작용이 얻어지며, ±1 이상 벌어진 영역에서의 사용은 희망적이지 않다. 또한 온도, 완충제의 농도 혹은 buffer의 이온조성 변화에 의해 buffer의 pH가 변동하게 되는데, 이 변동을 적게 하는 것이 중요한 경우가 종종 있다. 사용 pH 이외에는 ① 분광학적인 방법에 의한 측정과 단백질의 검출 (크로마토그래피의 경우 등)을 방해하지 않는다. ② 효소적 또는 비효소적인 반응의 경우에 완충제 자신이 변화하거나 반응을 저해하지 않는다. ③ 금속 이온과 복합체를 형성하지 않는 성질 등이 선택의 조건이 된다.
2. Buffer의 예
- Glycine Buffer (pKa = 2.35)
- Acetate buffer (pKa = 4.76)
- MOPS buffer : 3-(N-mopholino) propanesulfonic acid (pKa = 7.15)
- Phosphate Buffer (pKa = 7.22)
- HEPES buffer : N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (pKa = 7.55)
- Tricine Buffer : N-tris(hydroxymethyl) methylglycine (pKa = 8.15)
- Tris buffer : tris(hydroxymethyl) aminomethane (pKa = 8.3)
3. Buffer의 조제
Buffer를 조제할 때의 일반적인 주의점으로서 buffer의 희석, 염 등의 첨가물 혹은 온도 변화에 따른 pH의 변동이 있다. 통상, 농도가 높은 buffer(보존용액)를 준비해 두고 이것을 희석할 때에 필요한 첨가물을 가해서 실제로 사용하는 buffer를 만드는 경우가 많기 때문에 완충제의 종류에 따라서는 희석 후에 다시 pH를 확인할 필요가 있다. 온도에 관해서는 저온에서 사용하는 경우에도 실온에서 pH를 맞추는 경우가 많은데, 온도 변화에 따라 pH가 변동해소 chromatography 등의 재현성에는 문제가 없는 경우가 대부분이다. pH의 변동이 문제가 되는 경우는 사용 온도에서 pH를 조정한다. 0.05M Tris buffer는 25℃부터 5℃까지의 온도 저하에 따라 0.5~0.6 정도의 pH가 상승한다.