단백질의 아미노산 서열이 folding에 영향을 미친다는 사실을 시험관 내에서(in vitro) 실험을 하여 알아내었다.
열에너지나 pH에 의해 아미노산 가지사슬의 전하가 변할 수도 있고, 요소(urea)나 6-8 M의 구아니딘 염산(guanidine hydrochloride)과 같은 화학약품에 의해 비공유결합이 깨져서 단백질이 비정상적 형태로 바뀔 수도 있다. 이와 같이 단백질이 형태가 변형되고 활성을 잃게 되는 것을 변성(denaturation)이라 한다. 대부분의 변성된 단백질은 용액 내에서 침강하게 되는데, 이는 평상시에는 분자의 안쪽에 존재하던 소수성기들이 접힘이 풀리면서(unfolding) 서로 엉겨 붙게 되어 물에 녹지 않고 가라앉기 때문이다. 8M 농도의 요소나 β-mercaptoethanol과 같은 화학약품들은 황결합(disulfide bond, -S-S-)을 환원시켜 주어 단백질의 접힘을 완전히 펴주는 역할을 한다. 그러나 투석(dialysis)에 의해 이와 같은 화학물질들을 제거하면 다시 원래대로 단백질이 접히게 된다(refold). 이를 탈변성(renaturation)이라고 하며, 탈변성이 일어나는 동안 모든 황, 수소, 소수성 결합들이 정상적 형태로 돌아와 안정하게 된다. 그러므로 이러한 경우의 단백질들은 변성과 탈변성의 주기를 통해 파괴되었던 단백질이 다시 원래의 구조와 기능을 회복하게 된다는 것을 알 수 있다. 그리고 적어도 시험관 내에서는 탈변성 과정 중에 보조인자나 다른 단백질이 필요하지 않기 때문에 단백질의 접힘(folding)이 자가조립과정이라는 것을 알 수 있다.
크리스챤 안핀센(Christian Anfinsen)은 RNA의 활성을 감소시키는 효소인 ribonuclease를 가지고 변성과 탈변성을 관찰하였다. 그는 시험관 내 실험(in vitro)에서 탈변성 조건이 까다로우며, 탈변성 반응이 한 번에 이루어지는 것이 아니라 시간 차를 두면서 이루어진다는 것을 알아 내었다. 그래서 폴리펩타이드가 삼차 구조의 단백질로 folding이 이루어질 때, 중간 단계인 "molten globule(용해된 소구체)"이라는 상태를 거쳐서 단백질의 탈변성이 일어남을 알게 되었다. Ribonuclease의 경우에는 내부에 몇 개의 disulfide bond가 있어서 접힘 과정동안 이러한 disulfide bond의 재구성이 이루어지게 된다.