동결세포주 배양법

가. 동결세포주 배양법

1. 앰플을 드라이아이스 용기에서 꺼낸후 37-40℃의 수조에 넣는다
2. 40-60초 동안 신속하게 녹인다. 
3. 얼음이 녹자마자 수조에서 앰플을 꺼낸 후 상온의 70%알콜속에 넣어 소독한다.  이 순간부터 무균작업대에서 작업을 실시한다. 
4. 다시 알콜솜으로 앰플을 재소독한다. 알콜솜이나 여러겹의 소독된 타올 사이에 앰플을 넣은 후 황금색의 띠가 둘러진 앰플의 목부위를 부러뜨린다. 
5. DMSO(dimethylsulfoxide)를 제거하기 위하여 15ml 튜브에 키우고자하는 배양액(10% FBS가 첨가된 RPMI1640 혹은 DMEM)을 10ml 정도 넣은 다음 앰플속의 세포부유액(1-1.5ml)을 옮긴다. 
6. 1,000 rpm(200-400g)에서 3분간 원심분리한다.
7. 상층액을 제거한 후, 약 5ml의 배지에 cell pellet을 부유시킨다.
8. 배양용 플라스크(T25cm²)에 세포부유액(cell suspension)을 옮긴다.
9. 플라스크의 한면에 앰플에 인쇄된 세포이름과 배양날짜 배지 등을 기입한다.
10. 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 배양한다.
11. 배지는 세포가 자라는 양상을 관찰하면서 교체한다. 즉, 바닥면적의 약 80%이상을 세포들이 차지하며 배지의 색깔이 변하면 배지의 약 80%정도를 교체해 준다.
12. 세포가 충분히 자랐을 경우, 필요에 따라 T75cm²플라스크에 옮긴다.  

나. 단층세포 배양법

- 배양용기는 배지로 완전히 채워진 상태

1. 플라스크의 입구주변을 소독한 후 5ml정도의 배지만 남겨놓은채 모든 배지를 제거한 후 37℃ 배양기에서 배양한다. 때로는 취급도중에 세포들이 떨어져 배지속에 부유하여 있을 수 있으므로, 플라스크 내의 모든 배지를 원심분리용관에 옮긴 후 1,000 rpm에서 3분정도 원심분리하여 cell을 모은 후, 5ml정도의 배지만 남긴 후 나머지 배지는 제거한다.
2. 세포를 부유시킨 후 배양용 플라스크(T25cm²)에 옮긴다.
3. 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 배양한다.
4. 배지는 1주일에 두번정도 80%를 교체한다. 

 

다. 부유세포 배양법

- 세포는 15ml 원심분리용관에 배지로 완전히 채워진 상태

1. 1,000 rpm에서 3분정도 원심분리하여 cell을 모은 후, 5ml정도의 배지만 남긴 후 나머지 배지는 제거한다.  세포를 부유시킨 후 배양용 플라스크(T25cm²)에 옮긴다.
2. 5%의 CO₂와 95%의 공기가 공급되는 37℃의 배양기에서 배양한다.
3. 배지는 1주일에 두번정도 80%를 교체한다.