Immunohistochemistry

Immunohistichemistry (면역염색)

  - 특이적인 항체(antibody, 이하 Ab)로 세포, 조직 내의 target 항원(antigen, 이하 Ag)의 위치와 분포 동정이 목적
  - Ab는 형광물질(fluorescent), colorimetric label이 붙어 있어, label 위치로 target Ag의 위치를 파악할 수 있는 것임.



Protocol 1

1. 목적 : cytokine을 monoclonal Ab (단일클론항체)를 이용하여 indirect staning!!
            ex) IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-r, TNF-α

2. 재료 및 장비
  - Frozen sections (동결절편) of sample tissues
  - Glass slides
  - Cover slips
  - 4% paraformaldehyde, pH 7.4
  - Tris-buffered Saline, 0.1% Saponin, pH 7.4
  - Tris-buffered Saline/ 0.3% H2O2/ 0.1% Saponin, 0.02% NaN3
  - 1% Goat Serum in TBS/ Saponin
  - Refrigerator (4도)
  - Primary Ab
  - Secondary Ab
  - Diaminobenzidine tetrachloride 
  - Hematoxylin
  - Ethanol
  - Microscope

3. Procedure
  1) 실온에서 2시간 동안 동결조직 절편 (8um thickness)을 말린다.
  2) 실온에서 절편을 4% paraformaldehyde로 15분간 고정시킨다. (Fixation)
  3) TBS/ 0.1% Saponin으로 slide를 각각 5분씩 washing (2번 * 5분)
  4) TBS/ H2O2/ Saponin/ NaN3에 30분간 incubation, endogenous peroxidase block
  5) TBS/ Saponin으로 slide washing (3번 * 3분)
  6) TBS/ Saponin으로 1/100으로 희석시킨 goat serum을 20분간 처리하여, non-specific한 binding site를 block
  7) Ab로 4도씨에서 overnight incubation
  8) TBS/ Saponin으로 slide washing (4번), biotin이 붙은 secondary Ab(이하 2nd Ab)로 30분간 slide와 incubation
  9) Avidin-biotin-peroxidase를 첨가한 후, distilled water(증류수, 이하 D.W)에 희석시킨 0.5mg/ml DAB solution으로 slide를 incubation시킨다. 그러면 Ag-primary Ab의 정도가 갈색 침전 (precipitate)이 생기게 되어, 이것으로 peroxidase activity를 측정한다.
  10) TBS로 slide washing (4번)
  11) Hematoxylin으로 1분간 counterstaining (착색)
  12) 75% -> 80% -> 100% ethanol 순서로 각각 1분씩 slide를 dehydration
  13) Slide sealing
  14) Optical microscope로 분석


Protocol 2

1. 목적 : 
  - Intracellular phosphate residue의 indirect staining. Phosphorylation (인산화) state-specific Ab는 1) 단백질 내의 특정 residue가 인산화되었는지 확인하는데 유용하게 사용된다. 2) 인산화된 단백질의 세포내 위치 (subcellular localization) 결정한다
  - 단백질의 인산화는 단백질을 세포 내의 새로운 장소로 가게 한다. 
    ex) membrane, focal adhesion, nucleus 등

2. 재료 및 장비
  - Sample cells/ Stimulant
  - Glass slides and cover slips
  - PBS
  - 3.7% & 10% formaldehyde in PBS
  - 10% paraformaldehyde
  - 0.2% Triton X-100
  - Methanol
  - 0.06% Triton X-100/ PBS
  - 30% H2O2
  - 1% BSA
  - Primary Ab
  - Secondary Ab
  - GelMount
  - Fluorescent microscope
  - Goat serum