FACS

1 - color FACS Staining Procedure


1. Cell을 FACS buffer에 부유시킴 (약 10의 5제곱 cell / 50 ul 정도 되도록 함) 부착세포의 경우에는 trypsin 또는 EDTA 등을 활용하여 부유시킨다. 이때 trypsin 등의 처리에 의해 표적의 표면 분자가 영향을 받는 경우에는 기타 방법을 고려하여야 한다.

2. 50 ul을 tube에 분주한다.

3. 50 ul의 항체를 첨가한다. 일반적으로 5 ug / ml 의 항체 농도가 되도록 항체를 첨가한다. 그러나, 적용하는 최적의 항체 농도를 결정하기 위해서는 각각의 항체별로 titration을 하여 적정한 항체 농도를 결정하여야 한다.

4. 냉장 또는 on ice 상테에서 1시간 배양한다. (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다.)

5. 1ml 의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.

6. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.

7. 50 ul의 2nd Ab를 첨가한다. FITC/PE-conjugated (Fab)'2 타동물 유래의 anti-1차 항체 유래 동물의 항체 Ab (세포가 유래된 동물의 Ig으로 absorbed) 를 사용하면 가장 이상적이다. 그러나 일반적으로 Fluorescence-label된 타동물의 항 1차 항체  Ab를 사용하며 이 경우에 1차 항체 적용 단계가 끝난 후 (제 6단계후), 2~10% 의 2차 항체 생성동물의 serum을 이용하여 30분 정도 blocking 단계를 추가한다.

8. 냉장 또는 on ice 상태에서 1시간 배영한다 (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다)

9. 1ml의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.

10. 우너심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.

11. 200ul의 staining buffer (PI solution을 첨가한 것 사용) 에 재부유시켜서 즉시 FACS 분석을 실시한다. (PI solution이 세포에 적용된 이후에는 5분 이내에 FACS 분석에 사용하고 늦어도 10분 안에는 FACS 분석을 끝내는 것이 좋다)

12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)