단백질 실험 노트

1. 단백질 실험의 진행방향

① 기본적인 실험의 흐름

  단백질을 취급하는 실험실은 실로 다양하다. 그러나 그 중에 가장 많은 경우는, 특정한 단백질의 구조, 기능, 생리적 역할 등의 해명을 목적으로 한 연구일 것이다. 
  예를 들면 A세포의 배양액 중에 B세포에 대한 세포 증식활성이 보인다고 하자. 이 증식인자의 구조와 생리적 역할을 명확하게 하기 위해서는 먼저 그 배양액에 존재하는 증식 인자에 대하여 추출하여 정제하고, 이러한 생리 활성을 가지는 단백질 분자를 동정할 필요가 있다. 만일 단백질이 다량으로 정제된 경우에는 정제된 단백질을 이용해서 보다 상세하게 생리활성을 해석 (예를 들면, 여러 가지의 세포에 대한 증식 활성과 세포 유도 활성 등의 해석), X선의 경정에 대한 구조해석과 NMR 등에 의한 입체구조 해석, 항체 제작 등을 행할 수 있다. 항체를 얻을 수 있으면 면역 조직화학에 의한 조직분포의 분석, 효소 항체법에 의한 조직 추출액과 체액 중의 단백질의 정량, 항체 column을 이용한 단백질의 쾌속 정제, 발현 벡터를 이용한 cDNA library의 항체에 의한 screening 등이 가능하게 된다. 그러나 일반적으로는 이러한 단계에서는 다량의 단백질을 얻기가 곤란하고 이러한 상세한 해석은 불가능하다. 특히, 입체구조의 해석을 위해서는 수십 mg의 정제 단백질이 필요하게 된다. 
 
   현대적인 단백질 연구법에는 정제 단백질을 이용한 성질의 해석보다도 cDNA cloning이 우선 순위가 된다. 수 ㎍~수십㎍의 정제 단백질을 이용한 부분적으로 일차구조 (아미노산 배열)를 결정하여, 데이터베이스의 검색에 의해 이 단백질이 미지의 단백질인지 아닌지를 알 수가 있다. 미지의 단백질이면, 그 아미노산 배열에 의해서 DNA probe를 제작하여 cDNA를 cloning한다. 이 단계에서 단백질의 전 일차구조와 기능 도메인이 결정되고, 기지의 단백질의 기능 도메인과의 상동성으로부터 그 단백질의 대략적인 기능을 유추할 수 있다. 또한 발현 벡터에 조합시킨 cDNA를 세포에 도입하고 그 단백질의 발현에 의한 세포 형질 (예를 들면 세포 증식능, 분화능)의 변화를 조사하거나 인위적인 점 돌연변이를 일으켜서 변이 단백질을 제작하고 그 작용을 분석할 수가 있다. 그 위에 in situ hybridization을 이용해서 목적 유전자를 생체 내에서의 발현 부위를 알 수가 있다. 

   단백질의 상세한 기능과 입체구조의 해석, 또한 항체의 제작 등을 위해서는 cDNA를 대장균, 효모, 누에, 동물세포 등에 대량으로 발현시켜, 유전자 제조합 단백질을 조제한다.  이 경우에도 재료에서 단백질의 추출 및 정제 조작이 필요하게 된다. 대장균에서 발현시켜 도입체에 축적시킨 단백질의 경우에는 변성되고 불용성으로 되어있기 때문에 특수한 추출 조작과 활성을 갖는 단백질로의 재생 조작이 필요하게 된다. 

   상기의 연구 흐름에 있어서 목적 단백질의 정제, 일차구조 해석, cDNA 클로닝이 가장 중요한 단계라는 것을 알 수 있다. 유전자공학이 진보한 지금, 상기의 흐름과 달리 유전자 혹은 cDNA로 출발하는 경우가 많다. 예를 들면 cDNA subtruction법과 differential display법에 의해서 특정의 cDNA (예를 들면 전이성이 높은 암세포에서 특이적으로 발현하는 유전자)를 얻어서 그 cDNA가 code하는 단백질의 기능을 해석하는 것이다. 또한 genome project에 의해 얻어진 유전자 정보를 이용해서 목적 단백질의 부분 아미노산 정보에서 그 cDNA를 만들거나 단백질의 전 일차구조를 결정하는 것이 점점 간단하게 행할 수 있게 되었다. 그러나 천연형 혹은 유전자 재조합형의 어떤 것일지라도 단백질의 구조와 기능을 알기 위해서는 그 단백질을 순수하게 얻는 것이 필수 단계이다.




② 단백질 실험의 포인트 

  위와 같은 연구의 진행 방향이 결정되면 다음은 어떻게 하면 실험을 잘 할 수 있을 지가 중요하다. 단백질을 취급하는데 있어 특히 중요하다고 생각되는 기본적인 사항을 명심하여야 한다. 

  무엇보다도 첫번째로 목적 단백질의 양을 가능한 한 정확하고 간단하게 측정이 가능한 검정계를 가지는 것이다. 실험 재료중의 전 단백질 양과 목적 단백질의 양을 언제든지 가능한 한 정확하게 알고 있을 필요가 있다. 전체의 단백질 성분에 대해서는 SDS-PAGE법과 이차원 전기 영동법으로 간단하게 분석할 수가 있다.
  
  두번째로서, 좋은 실험 재료를 선택하는 것이다. 좋은 재료라는 것은 단순히 목적 단백질의 함량이 높다는 것만이 아니고 다른 불순물 단백질에 비하여 목적 단백질의 함량이 높은 재료를 의미한다. 이를 위해서는 목적 단백질의 조직분포나 세포내 분포를 확실하게 검토하여 둘 필요가 있다. 
   
  세번째는 단백질의 일반적인 성질뿐만이 아니라 목적 단백질 고유의 성질을 파악하는 것이다. 모든 단백질은 특정의 입체구조를 갖게됨으로서 처음으로 고유의 기능을 보여줄 수가 있다. 그래서 단백질의 생리활성을 분석하기 위해서는 단백질 입체구조의 파괴(변성)와 단백질분해효소에 의한 분해를 최소한으로 억제해야 한다. 

 많은 단백질은 열, pH, 변성제 및 산화 등에 의하여 용이하게 변성하고 활성을 잃는다. 화학시약을 용해하기 위해서는 가열하고 교반하지만, 단백질을 취급할 경우에는 ice bucket, 저온실이나 냉장고에서 1~5℃로 냉각해서 처리하는 것을 원칙으로 한다. 교반도 가능한 한 거품이 나지 않도록 조용하게 해야한다. 조직 추출액중의 단백질을 안정하게 유지하기 위해서는 용액을 저온으로 유지하는 것과 동시에 효소 저해제, 안정화 시약 등의 첨가가 필요한 경우가 많다. 또한 불안정한 단백질에 대해서는 시간도 중요한 factor이다. 일련의 실험은 가능한 한 짧은 시간에 행하지만, 그렇지 못할 경우 실험을 장기간 중단하는 경우에는 freezer나 초저온고에 동결보존 한다. 정제 단백질을 장기 보존하는 경우에는 분주해서 동결보존하지만 단백질에 따라서는 동결건조해서 냉장고에 보존하는 것이 무난하다. 또한 단백질을 정제하거나 처리하는 것 이상으로 그 단백질의 성질 (등전점, 분자량, pH 안정성, 흡착성 및 특정의 물질에 대한 결합성 등)을 알고 있는 것도 매우 중요하다. 
 
 이상과 같이 기본적인 사항과 더불어 개개의 실험을 얼마나 잘 수행하였는지가 연구의 성패를 결정하는 중요한 포인트가 되는 것은 말할 필요도 없다. 모든 실험기술에는 one point가 있다. 실험을 잘 할 수 있기 위해서는 그 방법의 원리를 이해하고 실험 과정을 습득하는 것이 매우 중요하다.