분리 정제법

1. 정제의 조립 방법

1-1. 정제를 시작하기 전
단백질은 변성, 분해 및 흡착 등에 의해서 실활되거나 소실된다. 따라서, 단백질의 정제는 이러한 손실을 피하고, 가능한 한 짧은 시간에 효율 좋은 일련의 방법이 이루어져야 한다. 단백질 정제를 효율좋게 행하기 위해서 특히 중요한 것부터 이하에 기술하고자 한다.

1) 활성 측정
목적 단백질의 존재량을 가능한 한 정확하고 간편하게 검정할 수 있는 방법을 가지고 있는 것이 매우 중요하다. 검정시간이 길어지게 되면 정제기간이 길어질 뿐 아니라 정제 자체도 곤란하게 되어진다.

목적	정제 단백질
N말단 아미노산 배열의 분석	10 ~ 50 pmol
분자내 아미노산 배열의 분석	100 ~ 500 pmol
아미노산 조성분	약 100 pmol
분자량 (질량분석)	0.1 ~ 10 pmol
생리 기능의 해석	0.01 ~ 1mg
항체 제작	0.1 ~ 10 mg
고차 구조의 해석	10 ~ 100mg

표. 단백질 정제를 위한 용량 
* 분석 능력이 높은 기기를 사용한 경우

• • 분자량이 수만 이하의 단백질
    

2) 정제의 목표
실험의 목적에 의해서 정제법의 조립방법이 크게 달라진다. 표에 여러 가지의 실험 목적에 따라 필요한 단백질량의 예를 나타냈었다. 예를 들면, 클로닝을 위한 일차구조 (아미노산 배열)의 분석을 하고자 할 경우 정제된 단백질은 변성되어 있어도 무방하다. 분석 능력이 높은 자동 아미노산 배열 분석장치 (protein sequencer) 를 사용하는 경우 10 pmol (분자량 1만의 단백질로서 0.1 ug) 로서 최고 수십 개의 N 말단 아미노산 배열 결정이 가능하다. 최종적으로 정제되는 표준폼은 여분을 두어 2 ~ 3 배의 정제가 필요하다. N 말단 아미노산이 블록되어 있으면 N 말단 배열 분석이 어렵다. 이 경우 정제 단백질을 제한 분해하고 내부의 배열을 보고자 할 경우에는 또 다시 그 수배의 정제가 요구된다.

좋은 DNA probe를 합성하기 위하여서는 가능한 한 많은 아미노산 배열을 가지고 있는 것이 중요하다. 최근, 단백질용의 질량분석 장치의 개량이 눈부시게 발전되어 있고, 단백질이나 펩티드의 일차구조해석의 정밀도나 미량화가 보다 진전되어 있다. 한편, 생리활성의 해석을 위하여서는 당연히 미변성의 상채로 통상 수십 ug이상의 단백질이 필요하다. 그리고, 입체구조의 해석을 위하여서는 수십 mg 이상의 미변성 단백질, 항체제작을 위하여서는 통상 수백 ug 정도의 미변성 또는 변성 단백질이 필요하게 된다.

3) 양질 대료 확보
목적단백질의 절대 함량과 상대 함량 (또는 비활성 : 전체의 단백질량에 대한 목적 단백질의 활성) 이 높은 재료를 선별한다. 정제에 있어서 단백질의 회수율은 수 %부터 수십 %의 범위가 대부분이다. 출발재료가 불충분하면, 정제하는 도중에 목적 단백질이 없어지게 되며, 재료의 제조부터 다시 출발하여야만 한다. 이러한 것을 피하지 않으면, 언제나 목적 단백질의 정제는 불가능하다. 처음부터 출발재료에 존재하는 목적 단백질의 양을 예측하고, 충분한 분량을 확보하여야만 한다. 매우 대략적인 측정으로서 cytokine 이나 효소는 수 ng이거나 수십  ng 정도에서 활성 검출이 가능하며, 특별히 높은 비활성을 가진 것은 수십 pg에서도 검출이 가능하다. 비활성 1단위/ng의 단백질을 10%의 수율로서 10ug 을 얻기 위하여서는 출발 재료에 최저 1*10의 5제곱 단위의 활성이 존재하고 있을 필요성이 있다.

4) 단백질의 안정화
단백질의 안정성은 정제의 효율에 크게 영향을 미친다. 불안정한 단백질에 대해서는 먼저 안정화의 조건을 발견하지 못하면 정제를 하여도 성공률은 거의 낮다. 단백질의 회수율이 나쁠 경우 원인과 대책에 관하여 논할 필요가 있다.

불안정한 단백질의 경우에는 효소 저해제 (inhibitor), 계면활성제, 염농도, SH보호제, glycerol, 금속 이온, pH 등의 효과를 조사하여 최대한 안정화로 고회수율의 조건을 조사해 두어야 한다. 이러한 보조인자들 중에서 단백질의 추출이나 분획에 자주 사용되어지는 protease inhibitor에는 여러 종류가 있다. Serine protease에는 Pefabloc SC, PMSF, leupeptin을, metalloprotease에는 EDTA, 산성 protease에는 E-64, pepstatin 등을 권장한다. 이러한 inhibitior의 혼합물이 Roche-Giagnosteck 사로부터 시판되고 있다. 열에 안정한 단백질이라도 시료를 실온에 방치하게 되면, 섞여있는 protease에 의하여 분해되기도 하고, 미생물에 의한 오염이 있을 수도 있다. 짧은 시간에 종료하는 HPLC 등을 예외로 하고 시료는 일반적으로 1~5'C 정도의 저온 (Ice bucket, 저온실, 냉장실)에 보존하여야 한다. 단백질은 안정되고, 순도가 높게 되어지는 정제의 최종단계에서 유리나 플라스틱의 표면에 흡착하여 손실하는 경우가 있다. 이러한 경우에는 buffer에 0.1% 정도의 계면 활성제 (예: Brij35, Triton X-100, CHAPS) 등을 첨가하기도 하고 비흡착성 tube(예: Nunc 사 mini soft)나 silicon으로 coat한 tube 등을 사용하는 등의 대책이 필요하다.


1-2. 정제의 진행방법