면역 침강법

면역침강법(immunoprecipitation)은 항체와 항원의 친화성을 이용하여, 용액으로부터 항원 (또는 항원과 친화성을 가진 물질)을 특이적으로 분리한다. 침강시키는 방법으로 생체내 미량성분의 검출이나 분자간의 상호작용을 간단히 검색하는 방법으로서 널리 이용되고 있다. 특히 면역 침강법을 단백질표식 (RI 표식, biotin 표식 등), 세포의 분획법, SDS-PAGE, 및 Western blotting법 등과 재조합 (recombinant) 함으로써 목적 단백질의 생합성 과정이나 대사 경로를 반정량적으로 조사하는 것이 가능하다.

면역 침강법에서 가장 중요한 point는 이용하는 항체의 물질로서 항체에 대한 특이성이 높고, 아주 높은 친화성으로 반응하는 항체를 선택하지 않으면 안된다. 특히 단백질의 부분 peptide를 화학적으로 합성하고, 거기에 대한 항체를 작성한 경우나 천연 단백질과는 다른 protein과 재조합 단백질을 항원으로서 이용한 경우, Western blotting에서 반응하는 것, 용액 중에서는 천연 단백질과 결합하지 않는 항체가 만들어져 있기 때문에 각각의 방법에서 항체의 성질을 조사하여 미리 check하여 둘 필요가 있다.


1. 일반적인 방법과 원리

 

면역 침강법에서는 우선 1) 항원을 포함한 용액에 항체 (일차 항체)를 첨가하고, 용액중의 항원-항체 복합체를 형성시킨다. 다음으로 2) protein A 또는 항 IgG 항체 (이차 항체)를 agarose bead에 고상화한 것을 첨가하고, 생성된 복합체를 고상 (bead)에 흡착시킨다. 최후에 bead를 잘 washing한 후 3) 적당한 방법 (산 추출이나 SDS에 의한 추출)으로 bead로부터 항원을 추출하는 방법이다. 

효율이 높은 항원을 침강시키기 위하여서는 항원, 일차 항체 및 이차 항체의 양의 비가 매우 중요하다. 일반적으로 항우너에 대한 친화성이 높은 monoclonal 항체를 일차 항체로서 이용한 경우에서는 항원 < 일차 항체 < 이차 항체의 량비로 하면 좋지만, polyclonal 항체를 이용한 다분자 복합체를 형성시킬 경우에는 양비를 변화시켜 최적 조건을 검색할 필요가 있다. 

 


1) Monoclonal antibody를 이용할 경우

Monoclonal 항체는 일반적으로 항원 측의 한 종류와 반응부위 (epitope) 를 인식하기 때문에 한 분자의 항원에는 한 분자의 항체 밖에 결합되지 않는다. 그리고, 항원 - 항체 반응이 균일하기 때문에 Kd치를 정의하는 것이 가능하다. 반응용액 중의 일차항체 농도 Kd치보다 낮을 경우, 대부분의 항원이 항체와 복합체로 형성되어 있기 때문에 친화성이 높은 monoclonal 항체 (Kd < 10의 -8제곱M) 을 선택할 필요가 있다. 일차 항체 농도를 일단 올려보고, 이차 항체의 허용량을 초과하면 유리 (free) 의 일차 항체에 의하여 항원 - 항체 복합체와의 반응이 저해되어지기 때문에 주의하지 않으면 안된다.

2) Polyclonal antibody를 이용할 경우

Polyclonal 항체는 각각 종류의 항체 혼합물로서, 항원측의 반응부위도 친화성도 여러 종류이다. 그리고, 항원을 리간드로서 affinity chromatography로 정제하지 않는 이상 항원으로서는 친화성을 가지고 있지 않은 IgG 등이 포함되어 있다. Polyclonal 항체와 항원과의 반응은 다중가이기 때문에 복수의 항우너과 항체를 cross시키면 다분자복합체가 형성되어진다. 각각의 항원 - 항체 간의 결합이 약하더라도 다중가로 결합되어 있기 때문에 항원 - 항체 복합체는 안정되어 있다. 한편, 다분자복합체를 생기게 하는 항원과 항체의 양이 최적화일 경우, 과잉의 항체가 존재하게 되면 cross 형성은 저해되어지기도 한다. 그리고, 항체 내에는 특이성이 낮은 분자도 포함되어 있기 때문에 항원 이외의 물질이 다분자복합체 중에 혼입되어 있는 경우가 있으므로 background가 높에 나타나는 결점이 있다.