Immunohistochemistry

Immunohistichemistry (면역염색)

  - 특이적인 항체(antibody, 이하 Ab)로 세포, 조직 내의 target 항원(antigen, 이하 Ag)의 위치와 분포 동정이 목적
  - Ab는 형광물질(fluorescent), colorimetric label이 붙어 있어, label 위치로 target Ag의 위치를 파악할 수 있는 것임.



Protocol 1

1. 목적 : cytokine을 monoclonal Ab (단일클론항체)를 이용하여 indirect staning!!
            ex) IL-1, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-r, TNF-α

2. 재료 및 장비
  - Frozen sections (동결절편) of sample tissues
  - Glass slides
  - Cover slips
  - 4% paraformaldehyde, pH 7.4
  - Tris-buffered Saline, 0.1% Saponin, pH 7.4
  - Tris-buffered Saline/ 0.3% H2O2/ 0.1% Saponin, 0.02% NaN3
  - 1% Goat Serum in TBS/ Saponin
  - Refrigerator (4도)
  - Primary Ab
  - Secondary Ab
  - Diaminobenzidine tetrachloride 
  - Hematoxylin
  - Ethanol
  - Microscope

3. Procedure
  1) 실온에서 2시간 동안 동결조직 절편 (8um thickness)을 말린다.
  2) 실온에서 절편을 4% paraformaldehyde로 15분간 고정시킨다. (Fixation)
  3) TBS/ 0.1% Saponin으로 slide를 각각 5분씩 washing (2번 * 5분)
  4) TBS/ H2O2/ Saponin/ NaN3에 30분간 incubation, endogenous peroxidase block
  5) TBS/ Saponin으로 slide washing (3번 * 3분)
  6) TBS/ Saponin으로 1/100으로 희석시킨 goat serum을 20분간 처리하여, non-specific한 binding site를 block
  7) Ab로 4도씨에서 overnight incubation
  8) TBS/ Saponin으로 slide washing (4번), biotin이 붙은 secondary Ab(이하 2nd Ab)로 30분간 slide와 incubation
  9) Avidin-biotin-peroxidase를 첨가한 후, distilled water(증류수, 이하 D.W)에 희석시킨 0.5mg/ml DAB solution으로 slide를 incubation시킨다. 그러면 Ag-primary Ab의 정도가 갈색 침전 (precipitate)이 생기게 되어, 이것으로 peroxidase activity를 측정한다.
  10) TBS로 slide washing (4번)
  11) Hematoxylin으로 1분간 counterstaining (착색)
  12) 75% -> 80% -> 100% ethanol 순서로 각각 1분씩 slide를 dehydration
  13) Slide sealing
  14) Optical microscope로 분석


Protocol 2

1. 목적 : 
  - Intracellular phosphate residue의 indirect staining. Phosphorylation (인산화) state-specific Ab는 1) 단백질 내의 특정 residue가 인산화되었는지 확인하는데 유용하게 사용된다. 2) 인산화된 단백질의 세포내 위치 (subcellular localization) 결정한다
  - 단백질의 인산화는 단백질을 세포 내의 새로운 장소로 가게 한다. 
    ex) membrane, focal adhesion, nucleus 등

2. 재료 및 장비
  - Sample cells/ Stimulant
  - Glass slides and cover slips
  - PBS
  - 3.7% & 10% formaldehyde in PBS
  - 10% paraformaldehyde
  - 0.2% Triton X-100
  - Methanol
  - 0.06% Triton X-100/ PBS
  - 30% H2O2
  - 1% BSA
  - Primary Ab
  - Secondary Ab
  - GelMount
  - Fluorescent microscope
  - Goat serum

3. Protocol A : Used with prostate (전립선의) epithelial cells
  1) Cell들을 glass cover slip에 놓고, 붙을 수 있도록 overnight 배양한다.
  2) PBS로 1번 헹구어 준다. (rinse)
  3) Formaldehyde/ PBS로 15분간 cell들을 고정시킨다. (fixation)
  4) PBS로 1번 washing
  5) Triton X-100을 2분간 처리
  6) 1X PBS로 washing
  7) PBS로 희석시킨 1st Ab로 최소 1시간 incubation
  8) PBS washing (5분 * 3번)
  9) PBS로 희석시킨 2nd Ab (goat anti-rabbit Ig'g FTTC)로 1시간 incubation  
  10) PBS washing (5분 *3번)
  11) Gelmount를 이용하여 slide위에 각각의 cover slip을 mount
  12) Fluorescence microscope로 분석


3-1. Protocol B : Used with NIH3T3 and FIII cells
  1) Serum-free 배지에 24시간 incubation -> starve cells
  2) 적당한 자극으로 cell들을 stimulation
  3) 10% paraformaldehyde (in PBS)로 15분간 cell들을 고정 (fixation)
  4) PBS로 3번 rinse
  5) 100ml PBS에 있는 30% peroxide 1ml로 30분 incubation (peroxidase block)
  6) 100% methanol로 -20도씨에서 10분간 incubation시켜 cell을 permeabilize
  7) PBS로 cell rinse 3번
  8) 1% BSA로 30~60분 block
  9) PBS로 cell rinse 3번
  10) PBS (5% goat serum + 0.25% NP40)에 들어 있는 1st polyclonal Ab (300ng/ml~1ug/ml)로 incubation
  11) PBS로 3번 washing
  12) 2nd Ab (at 1:2000 in 2% goat serum in PBS, ex. goat anti-rabbit Ig's)로 incubation
  13) PBS로 3번 washing
  14) Conjugate vector ABC kit으로 30분. 각각의 reagent (in PBS)를 20ug/ml로 희석
  15) ABC reagent 첨가 (60분)
  16) PBS로 3번 washing
  17) DAB substrate 첨가 (각각 1ml 당 one tablet)

3-2. Protocol C : Used with Rat52, Swiss 3T3, NIH3T3 and HEK293 cells
  1) 10% paraformaldehyde로 RT(실온)에서 15분간 cell 고정 (fixation)
  2) 100% methanol로 -20도씨에서 10분간 permeabilization
  3) 1% BSA로 block
  4) 1st polyclonal Ab (at 300ng/ml)로 1시간 incubation
  5) Washing & fluorescein-labeled 2nd, goat anti-rabbit Ig's FITC 첨가

3-3. Protocol D : Used with Rat Brain Slices (30um floating rat brain sections)
  1) PBS로 5분씩 3번 washing
  2) Triton X-100/ PBS (0.06%)로 30분간 permeabilization
  3) PBS 5분 * 3번 washing
  4) PBS에 들은 3% normal serum으로 30분간 blocking (2nd Ab가 goat Ab면 goat serum)
  5) PBS에 들은 3% normal serum에 희석시킨 1st Ab로 4도씨에서 overnight incubation
  6) PBS 5분 * 3번 washing
  7) PBS에 희석시킨 2nd Ab (1:500~1:1000)으로 1시간 incubation
  8) PBS 5분 *3번 washing
  9) Fluorescent 2nd Ab의 경우, vectashield (+DAPI if nuclear marker is desired)
      HRP-conjugated 2nd Ab or biotin-streptavidin-HRP의 경우, substrate 첨가
  10) Develop until color is visible (~10분), 100% glycerol 또는 FluormountG로 mounting