<strong>1-2. 정제의 진행방법</strong></font>&nbsp;<br />조분획은 단백질의 양이 대단히 많을 경우 그것을 적당히 분획하는 방법이다. 그래서, 정제의 초기단계에 사용되는 경우가 많다. 모든 단백질은 분자량, 전하 (등전점), 소수성, 생리활성, 화학적 결합성 등에 있어서 서로서로 각각 다르다. 다수의 chromatography는 분자량의 차이를 이용하여 단백질을 분리하는 겔여과 chromatography와 단백질의 컬럼 항체와의 흡착력의 차이를 이용하는 흡착 chromatography로 나누어진다. 후자 중에서 이온교환 chromatography는 전하의 차이, 소수 chromatography는 소수성의 차이, affinity chromatography는 특정의 물질에 대한 결합성 (반응성)을 이용하여 단백질을 분리한다. 여기에 더하여 SDS polyacrylamide gel 전기영동법 (SDS-PAGE)나 이차원 전기영동법도 이용 가능하다. 각 분리수단의 특징과 연구의 목적을 고려하여서 정제법을 조립할 필요가 있다. 목적 단백질의 등전점 (pI), 분자량, 흡착성, pH 안정성, 특정물질에 대한 친화성 등의 성질을 처음부터 알고 있으면 정제 방법을 조립하는데 많은 도움이 있다.<br /><br />많은 chromatography 중에서 가장 정제효율이 높은 chromatography는&nbsp; affinity chromatography이다. 예를 들면, 항체 컬럼을 이용한 affinity chromatography의 경우 이 방법으로만 항원 단백질을 고순도 정제가 가능하다. 따라서, 모든 단백질 정제에 있어서 우선 이 방법이 사용되어질 수 있는지 검토하여야 한다. 다음으로 분리능이 높은 분리수단은 역상 chromatography와 SDS-PAGE나 이차원 전기영동법 등의 전기영동법이다.<br /><br />일차구조의 분석이나 항체 제작에서처럼 변성 단백질일지라도 좋은 경우에는 역상 chromatography와 SDS-PAGE가 통상적인 수단으로 되어 있다. 특히, 단백질의 N말단 배열의 결정이 목적인 경우에는 목적 단백질의 band가 명확히 동정되는 단계라면 다른 협잡물의 단백질이 들어 있을지라도 최종 단계로서 SDS-PAGE를 시험하여 볼 수 있다. 이차원 전기영동법은 분리능이 상당히 높지만 조작이 의외로 까다롭고 단백질의 조제량이 적다는 결점이 있다. 단백질을 활성을 가진 채로 분리할 경우에는 affinity chromatography, 이온교환 chromatography, 겔여과법, 소수성 chromatography 등 분리의 원리가 다른 방법을 잘 조합하여 정제하면 좋은 효과를 거둘 수 있다. 대부분의 chromatography는 분리능은 거의 낮고 시간도 걸리지만 처리능력 (한번에 분획되는 단백질의 양)이 높은 저압 chromatography (low pressure liquid chromatography 또는 연질 항체법) 와 역으로 처리능력은 낮지만 쾌속성과 분리능이 우수한 고속액체 chromatography (high performance 또는 high pressure liquid chromatography: HPLC) 로 행할 수가 있다. 중간의 능력을 가진 chromatography로서는 FPLC (fast protein liquid chromatography) 라 명명된 장치와 항체가 amersham pharmacia biotech사로부터 시판되고 있지만 여기서는 FPLC도 HPLC로 기술하고자 한다. 일반적으로 저압 chromatography법에서는 컬럼과 항체를 별도로 구입하여 필요한 크기에 맞는 충진 컬럼을 제작하지만, HPLC에서는 충진 컬럼을 구입하여 사용한다. 가능한 한 HPLC를 우선적으로 사용하지만, 대규모의 정제에서는 우선 황산암모늄 분획등의 전처리나 연질 chromatography으로 전체 단백질의 양과 용량을 적게한 후에 FPLC나 HPLC에서 행하여 보는 것이 일반적이다. 이러한 경우 최초의 연질 chromatography에서는 처리능력이 특히 큰 이온교환 chromatography가 우수하다. 우리들이 동물세포의 배양액 상층으로부터 각종의 생리활성 단백질을 정제하는 경우, 3L 정도의 배양액 상층을 80% 포화 황산암모늄에 의한 염석으로 100 ~ 200배 정도로 농축한 후 연질 항체에서의 겔 여과, 군 특이적 Affinity chromatography, 음이온 (혹은 양이온), 교환 HPLC, 역상 HPLC에 의해서 분획하는 것이 가장 대표적인 컬럼 조작으로 하고 있다.