Changes

<font size="2"><strong>1. Cell prep&nbsp;</strong><br />

3</font><font size="2"><strong>2. Centrifuge 13000rpm, 5분FACS buffer로 wasching (1ml씩)&nbsp;<br /></strong>- FACS buffer 조성 ; 1X PBS + 0.01% NaN3 (sodium azide) + 5% BSA<br />

<br /></font><font size="2"><strong>3. Centrifuge 13000rpm, 5분<br /></strong><br /><br /></font><font size="2"><strong>4. Pellet (cell) 남기고, 상등액은 제거한다.<br /></strong>- 6 well에 cell 남은 것이 있을 수 있으므로 EP tube에 옮길 때, 빈 6 well에 FACS buffer 1ml 첨가한다.<br />

<br /></font><font size="2"><strong>5. Blocking with rabbit serum (on ice 1hr, 100ul씩)<br /></strong>- 이 때 up&amp;down 해서 cell을 잘 풀어줘야 blocking 잘 된다. up&amp;down 후 다시 ice에 박아둔다.&nbsp;<br />

<br /></font><font size="2"><strong>6. FACS buffer로 washing<br /></strong>1) EP tube에 FACS buffer 1ml 씩 넣고 13000rpm에서 1분만 살짝 centrifuge.<br />

<br /></font><font size="2"><strong>7. Primary Ab (4-1BBL) on ice 1hr<br /></strong>&nbsp;&nbsp;&nbsp; </font><font size="2"><strong>Normal Rat IgG on ice 1hr (둘 다 농도는 10ug/ml)<br /></strong>- 각각의 sample, control tube에 각각 4-1BBLprimary Ab, Rat IgG 100ul씩 넣는다. (두 Ab는 농도도 같고, 넣어 주는 양도 동일하게 할 것)<br />- 넣어 준 후 up&amp;down을 충분히 해 준다.<br /><br /><br /></font><font size="2"><strong>8. FACS buffer로 washing<br /></strong>- Tube에 각각 1ml 씩 첨가 후 centrifuge. (13000rpm, 1분, suction)<br /><br /><br /></font><font size="2"><strong>9. Secondary Ab ; Rabbit-anti-Rat IgG RPE (형광물질) on ice 30분 ~ 1시간<br /></strong>- 1:200으로 희석시킨 secondary Ab를 각 tube에 100ul씩<br />- 이때에도 up&amp;down을 충분히 해 준다.<br /><br /><br /></font><font size="2"><strong>10. FACS buffer로 washing<br /></strong>- 각각의 tube에 FACS buffer 1ml씩 첨가후 13000rpm, 4도씨, 1분 centrifuge.<br />- 상등액은 제거한다.<br /><br /><br /></font><font size="2"><strong>11. FACS buffer에 resuspension (1X PBS + 0.01% NaN3)<br /></strong>- 마지막 단계에서는 FACS buffer 300ul 씩 첨가<br />- Vortexing 1번 해주고 (약 10초)<br />- 5ml round bottom test tube에 옮겨 준다. (up&amp;down 해 주면서)<br />- Ice에 박은 후 진행한다.</font>