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<strong><font style="BACKGROUND-COLOR: rgb(204,255,204)" size="4"><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffffff">에프에씨에스</font><br />
<br />
<font style="BACKGROUND-COLOR: #ccffff">1 - color FACS Staining Procedure</font></font></strong><br />
<br />
<br />
<font size="2">1. Cell을 [[FACS]] buffer에 부유시킴 (약 10의 5제곱 cell / 50 ul 정도 되도록 함) 부착세포의 경우에는 trypsin 또는 EDTA 등을 활용하여 부유시킨다. 이때 trypsin 등의 처리에 의해 표적의 표면 분자가 영향을 받는 경우에는 기타 방법을 고려하여야 한다.<br />
<br />
2. 50 ul을 tube에 분주한다.<br />
<br />
3. 50 ul의 항체를 첨가한다. 일반적으로 5 ug / ml 의 항체 농도가 되도록 항체를 첨가한다. 그러나, 적용하는 최적의 항체 농도를 결정하기 위해서는 각각의 항체별로 titration을 하여 적정한 항체 농도를 결정하여야 한다.<br />
<br />
4. 냉장 또는 on ice 상테에서 1시간 배양한다. (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다.)<br />
<br />
5. 1ml 의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
<br />
6. 원심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
<br />
7. 50 ul의 2nd Ab를 첨가한다. FITC/PE-conjugated (Fab)'2 타동물 유래의 anti-1차 항체 유래 동물의 항체 Ab (세포가 유래된 동물의 Ig으로 absorbed) 를 사용하면 가장 이상적이다. 그러나 일반적으로 Fluorescence-label된 타동물의 항 1차 항체 Ab를 사용하며 이 경우에 1차 항체 적용 단계가 끝난 후 (제 6단계후), 2~10% 의 2차 항체 생성동물의 serum을 이용하여 30분 정도 blocking 단계를 추가한다.<br />
<br />
8. 냉장 또는 on ice 상태에서 1시간 배영한다 (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다)<br />
<br />
9. 1ml의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
<br />
10. 원심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
<br />
11. 200ul의 staining buffer (PI solution을 첨가한 것 사용) 에 재부유시켜서 즉시 FACS 분석을 실시한다. (PI solution이 세포에 적용된 이후에는 5분 이내에 FACS 분석에 사용하고 늦어도 10분 안에는 FACS 분석을 끝내는 것이 좋다)<br />
<br />
12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)<br />
<br />
<br />
<font style="BACKGROUND-COLOR: rgb(204,255,204)" size="4"><strong>Intracellular stain 법<br />
<br />
</strong><font style="BACKGROUND-COLOR: rgb(255,255,255)" size="2">위의 protocol을 사용하는데, step 1 후에 다음의 과정을 추가한다.<br />
(intracellular stain을 위한 kit를 구입하여 실시하면 더욱 간편하다.)<br />
<br />
1) Cell을 고정시킨다.<br />
- 고정액은, ethanol, acetone, 1% Paraform aldehyde, 1% formalin 등을 사용할 수 있다.<br />
- 10분 정도 실온에서 고정한 후에, 충분한 양의 FACS buffer로 wash해 준다.<br />
<br />
2) 고정된 세포막에 항체가 통과할 수 있는 pore를 만들기 위한 처리를 해준다.<br />
- 일반적으로 (0.1% saponin, 0.5% BSA, 0.02% NaN3 in PBS) 액을 사용한다 (BSA나 NaN3는 생략가능)<br />
- 실온에서 약 20분 배양한다.<br />
<br />
3) 위의 protocol에서 step2 이후를 동일하게 실시한다.<br />
<br />
필요한 시약 및 참고사항<br />
<br />
- 항체 : 항체는 대체로 100~500ug.ml의 농도로 공급되며 필요한 양 만큼만을 따다가 희석해 놓는다. (10X로 희석), 즉 500ug/ml의 원액항체의 경우 300ul의 10X 항체액을 만들 경우, 30ul의 항체원액을 따다가 270ul의 항체 희석액을 섞어서 만든다. (원액항체는 분주하지 않고 보관함.) 희석한 항체는 4도씨에서 보관한다.<br />
(새로운 항체를 이용할 때는 항체를 계단 희석하여 가장 최적의 항체농도를 결정한 후에 사용해야 한다. 그러나 일반적으로 1~5ug/ml의 농도가 적당하다)<br />
<br />
- 항체 희석액 : PBS containing 0.02% sodium azide (NaN3), 0.1% BSA<br />
<br />
- FACS buffer : PBS containing 0.01% sodium azide, 2~5% serum (염색하고자 하는 세포가 유래한 동물종의 serum) (serum을 넣는 것은 Fc receptor의 blocking 용이므로 Fc receptor가 없는 세포의 경우에는 안넣어도 됨). high background sample의 경우에 세포가 유래한 동물의 serum을 2~10% 첨가하면 background stain을 낮출 수 있다.<br />
참고) Blocking을 위해서 2) 단계 다음에, 항체를 만든 동물의 serum 2~5%를 첨가한 PBS를 100ul 넣어주고 30분간 배양하여 우너심으로 상청액을 제거하고 90ul의 FACS buffer에 재부유시켜 3)의 단계로 진행하기도 한다.<br />
<br />
Propidium Iodide (PI)<br />
- Stock solution으로 0.5 mg/ml로 만들어서 냉동보관 (-20도)<br />
- staining buffer에 1/200으로 희석하여 사용<br />
<br />
<br />
</font><br />
<strong>[[실험에서 사용한 Protocol]] <br />
<br />
</strong></font></font>
<br />
<font style="BACKGROUND-COLOR: #ccffff">1 - color FACS Staining Procedure</font></font></strong><br />
<br />
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<font size="2">1. Cell을 [[FACS]] buffer에 부유시킴 (약 10의 5제곱 cell / 50 ul 정도 되도록 함) 부착세포의 경우에는 trypsin 또는 EDTA 등을 활용하여 부유시킨다. 이때 trypsin 등의 처리에 의해 표적의 표면 분자가 영향을 받는 경우에는 기타 방법을 고려하여야 한다.<br />
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2. 50 ul을 tube에 분주한다.<br />
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3. 50 ul의 항체를 첨가한다. 일반적으로 5 ug / ml 의 항체 농도가 되도록 항체를 첨가한다. 그러나, 적용하는 최적의 항체 농도를 결정하기 위해서는 각각의 항체별로 titration을 하여 적정한 항체 농도를 결정하여야 한다.<br />
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4. 냉장 또는 on ice 상테에서 1시간 배양한다. (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다.)<br />
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5. 1ml 의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
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6. 원심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
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7. 50 ul의 2nd Ab를 첨가한다. FITC/PE-conjugated (Fab)'2 타동물 유래의 anti-1차 항체 유래 동물의 항체 Ab (세포가 유래된 동물의 Ig으로 absorbed) 를 사용하면 가장 이상적이다. 그러나 일반적으로 Fluorescence-label된 타동물의 항 1차 항체 Ab를 사용하며 이 경우에 1차 항체 적용 단계가 끝난 후 (제 6단계후), 2~10% 의 2차 항체 생성동물의 serum을 이용하여 30분 정도 blocking 단계를 추가한다.<br />
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8. 냉장 또는 on ice 상태에서 1시간 배영한다 (경우에 따라서는 30분간 하여도 무방하다)<br />
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9. 1ml의 staining buffer를 첨가하고 부드럽게 mix한다.<br />
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10. 원심하여 (3000rpm, 5분), 상청액을 제거한다.<br />
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11. 200ul의 staining buffer (PI solution을 첨가한 것 사용) 에 재부유시켜서 즉시 FACS 분석을 실시한다. (PI solution이 세포에 적용된 이후에는 5분 이내에 FACS 분석에 사용하고 늦어도 10분 안에는 FACS 분석을 끝내는 것이 좋다)<br />
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12. FL3에 양성인 세포는 gate-out 시킨다. (PI에 염색된 세포로 죽은 세포들임)<br />
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<font style="BACKGROUND-COLOR: rgb(204,255,204)" size="4"><strong>Intracellular stain 법<br />
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</strong><font style="BACKGROUND-COLOR: rgb(255,255,255)" size="2">위의 protocol을 사용하는데, step 1 후에 다음의 과정을 추가한다.<br />
(intracellular stain을 위한 kit를 구입하여 실시하면 더욱 간편하다.)<br />
<br />
1) Cell을 고정시킨다.<br />
- 고정액은, ethanol, acetone, 1% Paraform aldehyde, 1% formalin 등을 사용할 수 있다.<br />
- 10분 정도 실온에서 고정한 후에, 충분한 양의 FACS buffer로 wash해 준다.<br />
<br />
2) 고정된 세포막에 항체가 통과할 수 있는 pore를 만들기 위한 처리를 해준다.<br />
- 일반적으로 (0.1% saponin, 0.5% BSA, 0.02% NaN3 in PBS) 액을 사용한다 (BSA나 NaN3는 생략가능)<br />
- 실온에서 약 20분 배양한다.<br />
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3) 위의 protocol에서 step2 이후를 동일하게 실시한다.<br />
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필요한 시약 및 참고사항<br />
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- 항체 : 항체는 대체로 100~500ug.ml의 농도로 공급되며 필요한 양 만큼만을 따다가 희석해 놓는다. (10X로 희석), 즉 500ug/ml의 원액항체의 경우 300ul의 10X 항체액을 만들 경우, 30ul의 항체원액을 따다가 270ul의 항체 희석액을 섞어서 만든다. (원액항체는 분주하지 않고 보관함.) 희석한 항체는 4도씨에서 보관한다.<br />
(새로운 항체를 이용할 때는 항체를 계단 희석하여 가장 최적의 항체농도를 결정한 후에 사용해야 한다. 그러나 일반적으로 1~5ug/ml의 농도가 적당하다)<br />
<br />
- 항체 희석액 : PBS containing 0.02% sodium azide (NaN3), 0.1% BSA<br />
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- FACS buffer : PBS containing 0.01% sodium azide, 2~5% serum (염색하고자 하는 세포가 유래한 동물종의 serum) (serum을 넣는 것은 Fc receptor의 blocking 용이므로 Fc receptor가 없는 세포의 경우에는 안넣어도 됨). high background sample의 경우에 세포가 유래한 동물의 serum을 2~10% 첨가하면 background stain을 낮출 수 있다.<br />
참고) Blocking을 위해서 2) 단계 다음에, 항체를 만든 동물의 serum 2~5%를 첨가한 PBS를 100ul 넣어주고 30분간 배양하여 우너심으로 상청액을 제거하고 90ul의 FACS buffer에 재부유시켜 3)의 단계로 진행하기도 한다.<br />
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Propidium Iodide (PI)<br />
- Stock solution으로 0.5 mg/ml로 만들어서 냉동보관 (-20도)<br />
- staining buffer에 1/200으로 희석하여 사용<br />
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<strong>[[실험에서 사용한 Protocol]] <br />
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</strong></font></font>
