분리 정제법

1. 정제의 조립 방법

1-1. 정제를 시작하기 전
단백질은 변성, 분해 및 흡착 등에 의해서 실활되거나 소실된다. 따라서, 단백질의 정제는 이러한 손실을 피하고, 가능한 한 짧은 시간에 효율 좋은 일련의 방법이 이루어져야 한다. 단백질 정제를 효율좋게 행하기 위해서 특히 중요한 것부터 이하에 기술하고자 한다.

1) 활성 측정
목적 단백질의 존재량을 가능한 한 정확하고 간편하게 검정할 수 있는 방법을 가지고 있는 것이 매우 중요하다. 검정시간이 길어지게 되면 정제기간이 길어질 뿐 아니라 정제 자체도 곤란하게 되어진다.

목적	정제 단백질
N말단 아미노산 배열의 분석	10 ~ 50 pmol
분자내 아미노산 배열의 분석	100 ~ 500 pmol
아미노산 조성분	약 100 pmol
분자량 (질량분석)	0.1 ~ 10 pmol
생리 기능의 해석	0.01 ~ 1mg
항체 제작	0.1 ~ 10 mg
고차 구조의 해석	10 ~ 100mg

표. 단백질 정제를 위한 용량 
* 분석 능력이 높은 기기를 사용한 경우

• • 분자량이 수만 이하의 단백질
    

2) 정제의 목표
실험의 목적에 의해서 정제법의 조립방법이 크게 달라진다. 표에 여러 가지의 실험 목적에 따라 필요한 단백질량의 예를 나타냈었다. 예를 들면, 클로닝을 위한 일차구조 (아미노산 배열)의 분석을 하고자 할 경우 정제된 단백질은 변성되어 있어도 무방하다. 분석 능력이 높은 자동 아미노산 배열 분석장치 (protein sequencer) 를 사용하는 경우 10 pmol (분자량 1만의 단백질로서 0.1 ug) 로서 최고 수십 개의 N 말단 아미노산 배열 결정이 가능하다. 최종적으로 정제되는 표준폼은 여분을 두어 2 ~ 3 배의 정제가 필요하다. N 말단 아미노산이 블록되어 있으면 N 말단 배열 분석이 어렵다. 이 경우 정제 단백질을 제한 분해하고 내부의 배열을 보고자 할 경우에는 또 다시 그 수배의 정제가 요구된다.

좋은 DNA probe를 합성하기 위하여서는 가능한 한 많은 아미노산 배열을 가지고 있는 것이 중요하다. 최근, 단백질용의 질량분석 장치의 개량이 눈부시게 발전되어 있고, 단백질이나 펩티드의 일차구조해석의 정밀도나 미량화가 보다 진전되어 있다. 한편, 생리활성의 해석을 위하여서는 당연히 미변성의 상채로 통상 수십 ug이상의 단백질이 필요하다. 그리고, 입체구조의 해석을 위하여서는 수십 mg 이상의 미변성 단백질, 항체제작을 위하여서는 통상 수백 ug 정도의 미변성 또는 변성 단백질이 필요하게 된다.

3) 양질 대료 확보
목적단백질의 절대 함량과 상대 함량 (또는 비활성 : 전체의 단백질량에 대한 목적 단백질의 활성) 이 높은 재료를 선별한다. 정제에 있어서 단백질의 회수율은 수 %부터 수십 %의 범위가 대부분이다. 출발재료가 불충분하면, 정제하는 도중에 목적 단백질이 없어지게 되며, 재료의 제조부터 다시 출발하여야만 한다. 이러한 것을 피하지 않으면, 언제나 목적 단백질의 정제는 불가능하다. 처음부터 출발재료에 존재하는 목적 단백질의 양을 예측하고, 충분한 분량을 확보하여야만 한다. 매우 대략적인 측정으로서 cytokine 이나 효소는 수 ng이거나 수십  ng 정도에서 활성 검출이 가능하며, 특별히 높은 비활성을 가진 것은 수십 pg에서도 검출이 가능하다. 비활성 1단위/ng의 단백질을 10%의 수율로서 10ug 을 얻기 위하여서는 출발 재료에 최저 1*10의 5제곱 단위의 활성이 존재하고 있을 필요성이 있다.

4) 단백질의 안정화
단백질의 안정성은 정제의 효율에 크게 영향을 미친다. 불안정한 단백질에 대해서는 먼저 안정화의 조건을 발견하지 못하면 정제를 하여도 성공률은 거의 낮다. 단백질의 회수율이 나쁠 경우 원인과 대책에 관하여 논할 필요가 있다.

불안정한 단백질의 경우에는 효소 저해제 (inhibitor), 계면활성제, 염농도, SH보호제, glycerol, 금속 이온, pH 등의 효과를 조사하여 최대한 안정화로 고회수율의 조건을 조사해 두어야 한다. 이러한 보조인자들 중에서 단백질의 추출이나 분획에 자주 사용되어지는 protease inhibitor에는 여러 종류가 있다. Serine protease에는 Pefabloc SC, PMSF, leupeptin을, metalloprotease에는 EDTA, 산성 protease에는 E-64, pepstatin 등을 권장한다. 이러한 inhibitior의 혼합물이 Roche-Giagnosteck 사로부터 시판되고 있다. 열에 안정한 단백질이라도 시료를 실온에 방치하게 되면, 섞여있는 protease에 의하여 분해되기도 하고, 미생물에 의한 오염이 있을 수도 있다. 짧은 시간에 종료하는 HPLC 등을 예외로 하고 시료는 일반적으로 1~5'C 정도의 저온 (Ice bucket, 저온실, 냉장실)에 보존하여야 한다. 단백질은 안정되고, 순도가 높게 되어지는 정제의 최종단계에서 유리나 플라스틱의 표면에 흡착하여 손실하는 경우가 있다. 이러한 경우에는 buffer에 0.1% 정도의 계면 활성제 (예: Brij35, Triton X-100, CHAPS) 등을 첨가하기도 하고 비흡착성 tube(예: Nunc 사 mini soft)나 silicon으로 coat한 tube 등을 사용하는 등의 대책이 필요하다.


1-2. 정제의 진행방법 
조분획은 단백질의 양이 대단히 많을 경우 그것을 적당히 분획하는 방법이다. 그래서, 정제의 초기단계에 사용되는 경우가 많다. 모든 단백질은 분자량, 전하 (등전점), 소수성, 생리활성, 화학적 결합성 등에 있어서 서로서로 각각 다르다. 다수의 chromatography는 분자량의 차이를 이용하여 단백질을 분리하는 겔여과 chromatography와 단백질의 컬럼 항체와의 흡착력의 차이를 이용하는 흡착 chromatography로 나누어진다. 후자 중에서 이온교환 chromatography는 전하의 차이, 소수 chromatography는 소수성의 차이, affinity chromatography는 특정의 물질에 대한 결합성 (반응성)을 이용하여 단백질을 분리한다. 여기에 더하여 SDS polyacrylamide gel 전기영동법 (SDS-PAGE)나 이차원 전기영동법도 이용 가능하다. 각 분리수단의 특징과 연구의 목적을 고려하여서 정제법을 조립할 필요가 있다. 목적 단백질의 등전점 (pI), 분자량, 흡착성, pH 안정성, 특정물질에 대한 친화성 등의 성질을 처음부터 알고 있으면 정제 방법을 조립하는데 많은 도움이 있다.

많은 chromatography 중에서 가장 정제효율이 높은 chromatography는  affinity chromatography이다. 예를 들면, 항체 컬럼을 이용한 affinity chromatography의 경우 이 방법으로만 항원 단백질을 고순도 정제가 가능하다. 따라서, 모든 단백질 정제에 있어서 우선 이 방법이 사용되어질 수 있는지 검토하여야 한다. 다음으로 분리능이 높은 분리수단은 역상 chromatography와 SDS-PAGE나 이차원 전기영동법 등의 전기영동법이다.

일차구조의 분석이나 항체 제작에서처럼 변성 단백질일지라도 좋은 경우에는 역상 chromatography와 SDS-PAGE가 통상적인 수단으로 되어 있다. 특히, 단백질의 N말단 배열의 결정이 목적인 경우에는 목적 단백질의 band가 명확히 동정되는 단계라면 다른 협잡물의 단백질이 들어 있을지라도 최종 단계로서 SDS-PAGE를 시험하여 볼 수 있다. 이차원 전기영동법은 분리능이 상당히 높지만 조작이 의외로 까다롭고 단백질의 조제량이 적다는 결점이 있다. 단백질을 활성을 가진 채로 분리할 경우에는 affinity chromatography, 이온교환 chromatography, 겔여과법, 소수성 chromatography 등 분리의 원리가 다른 방법을 잘 조합하여 정제하면 좋은 효과를 거둘 수 있다. 대부분의 chromatography는 분리능은 거의 낮고 시간도 걸리지만 처리능력 (한번에 분획되는 단백질의 양)이 높은 저압 chromatography (low pressure liquid chromatography 또는 연질 항체법) 와 역으로 처리능력은 낮지만 쾌속성과 분리능이 우수한 고속액체 chromatography (high performance 또는 high pressure liquid chromatography: HPLC) 로 행할 수가 있다. 중간의 능력을 가진 chromatography로서는 FPLC (fast protein liquid chromatography) 라 명명된 장치와 항체가 amersham pharmacia biotech사로부터 시판되고 있지만 여기서는 FPLC도 HPLC로 기술하고자 한다. 일반적으로 저압 chromatography법에서는 컬럼과 항체를 별도로 구입하여 필요한 크기에 맞는 충진 컬럼을 제작하지만, HPLC에서는 충진 컬럼을 구입하여 사용한다. 가능한 한 HPLC를 우선적으로 사용하지만, 대규모의 정제에서는 우선 황산암모늄 분획등의 전처리나 연질 chromatography으로 전체 단백질의 양과 용량을 적게한 후에 FPLC나 HPLC에서 행하여 보는 것이 일반적이다. 이러한 경우 최초의 연질 chromatography에서는 처리능력이 특히 큰 이온교환 chromatography가 우수하다. 우리들이 동물세포의 배양액 상층으로부터 각종의 생리활성 단백질을 정제하는 경우, 3L 정도의 배양액 상층을 80% 포화 황산암모늄에 의한 염석으로 100 ~ 200배 정도로 농축한 후 연질 항체에서의 겔 여과, 군 특이적 Affinity chromatography, 음이온 (혹은 양이온), 교환 HPLC, 역상 HPLC에 의해서 분획하는 것이 가장 대표적인 컬럼 조작으로 하고 있다.