실험에서 사용한 Protocol

1. Cell prep 
- 6 well에 FACS buffer을 넣어주고,  scraping하여 eppendorf tube로 옮긴다. 이때, eppendorf tube는 ice에 박아 둔 상태에서 진행한다.


2. FACS buffer로 wasching (1ml씩) 
- FACS buffer 조성 ; 1X PBS + 0.01% NaN3 (sodium azide) + 5% BSA


3. Centrifuge 13000rpm, 5분


4. Pellet (cell) 남기고, 상등액은 제거한다.
- 6 well에 cell 남은 것이 있을 수 있으므로 EP tube에 옮길 때, 빈 6 well에 FACS buffer 1ml 첨가한다.
- Centrifuge 돌린 후 남은 tube (pellet만 남은 것) 에 다시 넣고, centrifuge 후 상등액은 suction한다.


5. Blocking with rabbit serum (on ice 1hr, 100ul씩)
- 이 때 up&down 해서 cell을 잘 풀어줘야 blocking 잘 된다. up&down 후 다시 ice에 박아둔다. 
- Cell들이 가라앉을 수 있으므로, 15분에 1번씩 taping 해 준다.
-> Control, sample 2 set로 나눈다. (sample 1ml중 500ul 따서 새 control tube에 넣는데, 이때에도 up&down을 충분히 해 준다.)


6. FACS buffer로 washing
1) EP tube에 FACS buffer 1ml 씩 넣고 13000rpm에서 1분만 살짝 centrifuge.
2) Pellet만 남기고 상등액 suction.


7. Primary Ab (4-1BBL) on ice 1hr
    Normal Rat IgG on ice 1hr (둘 다 농도는 10ug/ml)
- 각각의 sample, control tube에 각각 4-1BBL primary Ab, Rat IgG 100ul씩 넣는다. (두 Ab는 농도도 같고, 넣어 주는 양도 동일하게 할 것)
- 넣어 준 후 up&down을 충분히 해 준다.


8. FACS buffer로 washing
- Tube에 각각 1ml 씩 첨가 후 centrifuge. (13000rpm, 1분, suction)


9. Secondary Ab ; Rabbit-anti-Rat IgG RPE (형광물질) on ice 30분 ~ 1시간
- 1:200으로 희석시킨 secondary Ab를 각 tube에 100ul씩
- 이때에도 up&down을 충분히 해 준다.


10. FACS buffer로 washing
- 각각의 tube에 FACS buffer 1ml씩 첨가후 13000rpm, 4도씨, 1분 centrifuge.
- 상등액은 제거한다.


11. FACS buffer에 resuspension (1X PBS + 0.01% NaN3)
- 마지막 단계에서는 FACS buffer 300ul 씩 첨가
- Vortexing 1번 해주고 (약 10초)
- 5ml round bottom test tube에 옮겨 준다. (up&down 해 주면서)
- Ice에 박은 후 진행한다.