단백질 구조해석의 진행방법

단백질 구조해석의 진행방법

조직이나 배양세포로부터 매우 흥미있는 단백질의 분리에 성공한 다음, 그 생리기능을 해석할려고 할 경우 당연히 필수적으로 되어져야 하는 것은 단백질 구조상의 정보이다. 목적 단백질의 전 아미노산 배열을 결정하는 것에 의하여 그 생리활성은 더 나아가 세포내에서의 국재성, 번역후의 수절 등을 추측하는 것이 가능하다. 그리고 이미 구조가 명확히 밝혀져 있는 단백질과 기능적인 관련성이나, 진화과정에 있어서 부착되어지는 위치도 유용한 정보를 제공하여 주게 된다. 물론, 그 배열 자체가 물리 화학적인 측면에서 매우 흥미있는 화제를 제공하여 주는 경우도 있다. 게다가, 특이적인 항체 작제용의 항원을 design하기 위하여서도, 아미노산 배열의 정보는 필수 불가결 하다. 

유전공학적 수법이 일반화되어진 현재는, 단백질의 전 아미노산 배열을 화학적으로 결정하는 일은 부분적인 아미노산 배열을 우선 결정하고, 그러한 정보에 따라서 cDNA를 cloning하고, 염기배열로부터 전 아미노산 배열을 결정하는 방법이 일반적으로 되어 있다. 그리고, 최근에는 internet 상에서 이용 가능한 유전자 정보 bank가 활발하게 적극 활용되어지고 있으며, 일부 구조상의 정보 (아미노산 배열뿐만 아니라 질량 분석에 의한 peptide map) 에서 목적 단백질의 cDNA 정보가 computer로부터 얻을 수 있게 되어 있다. 이렇게 얻어진 cDNA는, 배양세포 등을 이용한 발현시험에 이용되어지고 세포공학, 분자생물학적인 연구에서 주역이 되고 있다. 이러한 흐름의 연구 과정은 목적 단백질의 부분적인 구조상의 정보를 결정하는 단계이다. 지금부터 이렇게 중요한 단계로서 이용되어지고 있는 실험 방법 등에 대해서 소개해 보기로 하겠다.

1. 단백질의 분리동정

단백질의 부분적인 1차 구조결정을 위하여서는, 우선 확실히 수행되지 않으면 안되는 것은 목적 단백질의 동정이다. 여기서 말하는 동정이란, 조직이나 세포의 단백질 추출액으로부터 목적으로 하는 생리활성을 수반한 단백질의 분리 정제를 진행하는 과정에서, 각종 전기영동의 gel상에서 어느 단백질의 밴드가 생리 활성을 가지는 가에 대하여 확정하는 것이다. 한편, 간단한 과정이지만, 이 단계를 쉽게 여기면 특히, 정제가 곤란한 미량 밖에 존재하지 않는 단백질을 해석할 경우에는 일차적으로 전혀 다른 정보를 얻게 되어지는 경우가 되고 만다. 수차례에 걸쳐 column-크로마토그래피 조작을 행하는 것이, 단백질을 순수품에 가깝게 정제하는 것이 그다음 단계후의 해석을 확실히 하기 위한 최적의 조건이다. 이러한 경우에도 여러 종류의 전기영동으로 분석하고, 그 밴드가 한 종류의 단백질로부터 되고, 생리활성도 항상 같이 수반되어야 한다. 최근에는 SDS-PAGE나 electro-transfer법을 이용하고, 부분 정제한 단백질 표준품으로부터 목적 단백질의 구조 해석을 행하는 방법이 이전부터 일반적으로 되어 있긴 하지만, 이러한 경우에는 아주 신중하게 밴드의 동정이 요구된다, 특이성이 높은 ligand와의 상호작용을 이용한 분리조작을 하기도 하지만, 역시 수차례의 전기 영동법에 의한 해석이 필요하게 된다. 

동정이 확실하게 이루어진 다음에 문제시되어지는 것은 이미 알려져 있는 분자와의 관련성이다. 만약, 목적 단백질과 생리활성이나 분자량이 닮은 분자에 대한 항체를 손쉽게 구할 수 있다면 Western blotting법에 의하여 이러한 단백질의 면역화학적인 관련성을 당연히 검토하여야 한다. 그리고 peptide mapping 법에 의하여 다른 단백질과의 관련성을 검토하는 것도 가능하다. 이러한 단계를 명백히 하면 목적 단백질의 구조해석에 진행이 순조롭게 진행되어지면, 여하튼 구조를 보지 않고서는 어떤 판단도 할 수 없는 이유 때문에 다음과 같이 해석 단계를 진행하는 경우에 대하여 기술하였다.

2. 단백질의 일차구조 해석법

단백질의 구조해석에 참깨를 이용하여 분석하여야 할 경우에 있어서 행하지 않으면 안된느 것은 해석방법의 선택에 달려 있다. 현재 놓여져 있는 단백질의 순도, 양을 고려하여 최적의 판단 방법을 결정한다. 역으로 연구실에 현재 설비로서 행하여질 수 있는 방법에 한하여 단백질의 조제를 행하지 않다면 안되는 경우도 있다.

1) High quality의 정제 단백질

목적 단백질이 고순도 (high quality) 로서, 대량 (50~100 ug 이상) 으로 조제가 가능하다면, 아미노산 배열의 정보를 얻는 것은 비교적 용이하다. 기본적으로는 적당한 protease로서 단백질을 소화시키고, 얻어진 peptide를 HPLC로서 분리 채취하고, 기상의 아미노산 sequence로서 아미노산 배열을 결정한다. 작은 단백질이라면, 화학적으로 전 아미노산 배열을 결정하는 것도 가능하다. 혹시, N말단이 아세틸화 (acetyl) 화 등으로 인하여 block 되어 있는 경우도 있는데 이러한 경우는 탈 block화 시키고 해석할 필요가 있다. 최근에는 이러한 이상적인 조건에서 해석하는 것이 보편화되어 있다.

2) 부분 정제 단백질

최근, 단순히 필요에 의하여 이루어지지만, 정제가 곤란한 아주 미량인 단백질의 해석이다. 한편, 유전자 정보 bank에 의하여 비교적 단순한 해석 (고가의 기기를 요함)을 행하는 일로서 cDNA를 얻기에 충분한 결과를 얻을 수 있는 것이 가능하다.

우선 목적 단백질의 밴드를 gel 상에서 정확하게 동정한다. 단백질 질량은 일반적으로 CBB 염색에서도 band가 보이지만, 질량 분석계의 해석이라면, 은 염색만으로도 충분하다. 여기서 주의하여야 할 것은 gel 상의 밴드가 어느 정도 깨끗하느냐에 따라 결과가 좌우된다. 목적하는 밴드가 확실히 보여도 배후의 조작한 단백질이 혼입되어 있는 경우가 종종 있다. 항체 column이나 결합 단백질을 이용한 affinity column으로부터 용출한 sample은 그러한 혼입물이 포함되어 있는 경우가 많으므로 주의를 요한다. 그리고 sample에 peptide성의 물질 (protease inhibitor 등)이 대량으로 포함되어 있지 않은가를 확인하여 둘 필요가 있다.

반면, 깨끗한 밴드가 동정되었을 때는, 다음 과정으로 protease를 조제하지만 여기서 단백질의 성질이나 연구자의 취향에 따라 두 가지의 방법으로 분류된다. 하나는 목적 단백질의 밴드를 PVDF막에 한 번 전사시키고 그 막 위에서 protease를 소화시켜 얻은 peptide를 분석하는 방법이다. 이러한 방법의 경우에 있어서는 목적 단백질이 효율이 높게 막 (membrane)에 잘 전사되어져야 하는 것이 필요 조건이며, 전사 효율이 높은 조건을 결정한 다음 행하면 양호한 결과를 얻을 수 있다. 또 다른 하나는 SDS-PAGE 등의 gel로부터 밴드를 잘라내고, gel 중에서 protease로서 소화하는 방법이다. 전사에 의한 loss가 거의 없고 단순하기 때문에 후자의 방법이 널리 이용되고 있다. Peptide를 회수하는 것은 전자나 후자의 방법 어느것이라도 가능하다.

회수한 peptide의 혼합물은 우선 질량 분석계 (MALDI-TOFMS 등) 에 걸어서 질량에 의한 peptide mapping 을 실시하고 이 단계에서 internet 상에서 이미 알려져 있는 단백질의 map과 조회를 실시한다. 사람이나 생쥐 등의 유전자 정보로부터 알려져 있고 이러한 종으로부터 분리한 단백질이라면 이미 알려져 있는 단백질 또는 EST clone과의 관련성을 추측하고, 경우에 따라서는 바로 결정되어질 수 있다. 간혹, 이러한 단계에서 작업을 몇 번이고 반복하여 보고 여기서 종료하는 경우도 많다. (기존의 단백질의 오염이 있거나 이종의 단백질 혼합이 있는가가 판단되어진다.) 혹시, 앞에서 기술한 peptide mapping이나 internet 사용 등에 의한 검색에 의하여 mass search로서 충분한 정보가 얻어진 경우에 있어서는 peptide를 HPLC로서 분리 채취하여, 가상의 sequence로서 배열 결정을 행할 필요가 있다. 최근에는 고감도의 sequence가 개발되어 있어 0.1 pmol 량으로서도 배열 결정이 가능하게 되어 있다. 그리고 혹시 이용 가능하다면, Q-TOF (tandem mass라 불림)에 의하여 질량 분석에 의한 아미노산 배열의 결정을 행하는 곳도 현실적으로 가능하게 되어 있다.