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Western Blotting

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* Western blotting의 troubleshooting *

<tbody>

<tr>

</tr>

<tr>

<tdcolspan="2"> 밴드가 많이 나타날 때</~~td>~~ ~~<td~~strong> </td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> 항체의 희석율과 특이성에 </td> <tdbgcolor="#ffffff"> 일차 항체의 농도 검정을 다시 측정 (일차 항체 없이 control도)</td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> </td> <tdbgcolor="#ffffff"> 이차 항체의 농도를 검정한다</td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> </td> <tdbgcolor="#ffffff"> 일차 항체를 affinity 정제한다</td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> 영동한 단백질량이 너무 많으면</td> <tdbgcolor="#ffffff"> 영동한 단백질량을 측정한다</td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> block이 불충분한게 된다</td> <tdbgcolor="#ffffff"> blocking을 1시간 이상 overnight 한다</td>

</tr>

<tr>

<tdcolspan="2"> <~~/td~~strong> 밴드가 전혀 나타나지 않음<td/strong> </td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> 항체역가가 약하거나 희석률이 부적당</td> <tdbgcolor="#ffffff"> 반드시 알고 있는 일차 항체를 positive control로 하고, 일차 항체, 이차 항체의  농도 검정을 다시 할 것 </td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> block이 약할 경우</td> <tdbgcolor="#ffffff"> blocking을 1시간 정도로 늘리고, 일차 항체를 overnight로 반응시킴 </td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> 항원이 적을 경우</td> <tdbgcolor="#ffffff"> 영동한 단백질을 증가시킨다 </td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> 검출법이 적당하게 없을 때 </td> <tdbgcolor="#ffffff"> DAB법으로 검출되지 않을 경우는 화학 발광법으로 검출한다  </td>

</tr>

<tr>

<tdbgcolor="#ffffff"> 적당한 buffer가 없을 때</td> <tdbgcolor="#ffffff"> Tween-PBS를 Tween-PBS (Tris buffer) 등으로 교환한다 </td>

</tr>

<tr>

<tdcolspan="2"> Membrane 전체가 검을 경우 </td> </tr> <tr> <td bgcolor="#ffffff"> blocking이 불충분</td> <td bgcolor="#ffffff"> 반드시 Tween을 넣은 blocking액을 사용하고, overnight로 block한다 </td> </tr> <tr> <td bgcolor="#ffffff"> 항체가 변성하여 있는 경우</td> <tdbgcolor="#ffffff"> 표식한 proteinA로 검출한다</td>

</tr>

</tbody>

3. 밴드의 정량

1) Scanner 또는 CCD 카메라를 이용한 방법

Western의 membrane이나 여과지 위에서 건조시킨 gel에서는 컴퓨터용의 scanner로 검출하는 것이 가능하다. CCD 카메라 이용이 가능하다면 그것으로 충분하다. 한편, 전기영동한 gel이나 X선 필름과 같은 투명한 sample이라면 정량성이 적고 깨끗한 화상을 얻기 위하여서는 투과광으로 사진을 찍을 수 있다. Scanner에 투과 원고 unit를 부착하여 사용하면 아주 간단하게 사진화 할 수 있다. CCD 카메라를 이용할 경우는 light focus에 sample을 놓고 실시하면 좋다. 컴퓨터에 저장한 화상을 정량하는 sample에서는 Macintoshi용의 NIH 이미지는 종전부터 널리 이용되고 있다. 화상을 TIFF형식으로 보존하면 NIH-image로 호환이 가능하다. 선택 sil(사각 점선)로 배선을 지정하여 analyze-measure 과정으로 측정하고 analyze-show result 과정으로 측정치가 표시되어 진다. 화상이 화면으로부터 나타나면 sil을 자유자재로 화면에서 움직일 수 있는 장점이 있다. 한편, X선 필름이라도 scanner가 가능하며, 처음부터 정량을 목적으로 만들어진 것이 아니라면 화상을 시각적으로 잘 나타낼 수 있도록 설계되어 있지만, 입력하는 빛의 강도와 signal의 강도가 반드시 정확하게는 직선관계가 되지 않는다. 그러한 반면, 수치로 나타낼 경우에는 상기의 어느 방법일지라도 충분하다.

2) 화학발광 검출용의 고감도 CCD카메라를 이용한 방법

화학발광의 signal은 고감도의 냉각 CCD 카메라를 이용하여 직접 검출하는 것이 가능하며, 그렇기 때문에 CCD 카메라 파스컴의 set가 시판되어지고 있다. X선 film을 사용하지 않는 분은 직선성이 손상되지 않고 dynamic 레인지도 광범위하다. 그리고 전용 set가 있다면 직선성과 같은 결과가 얻을 수 있게 설계되어 있기 때문에 이러한 것을 이용하여 보아도 좋을 것으로 생각한다.

3) 125I를 이용한 방법

Film나 digital 기기를 이용한 방법으로서 125I 표식의 이차 항체 (또는 protein A)를 사용하고, autoradiography 후 membrane으로부터 밴드를 잘라 r-counter로서 측정하는 방법이 있다. 밴드를 잘라낼 때 background를 제외시키는 것이 의외로 어렵지만, 간단하고 우수한 방법으로 알려져 있다. 검출에는 RI image analyzer를 사용하여도 무방하다.

4) Radioimmunoassay

항원을 보다 정확하게 정량하는 방법에는 radioimmunoassay나 enzymeimmuno-assay가 있다, 중요한 혈중의 인자 등은 assay kit가 시판되어 있지만, 일반적으로 생화학, 분자생물학의 연구자가 자기 스스로 system을 확립하는 기회는 거의 없고 상세히 기술한 도서가 있기 때문에 그러한 책을 참고하여야 한다.

[참고 문헌]

Antibodies, Harlow, E & Lane, D., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988

216.73.216.43

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