Western Blotting

Western Blotting

Western Blotting은 SDS-PAGE를 행한 후, 단백질을 membrane에 전사하고, 항체를 이용한 특정의 단백질을 검출하는 방법이다. 목적의 단백질에 대한 항체를 가지고 있으면, 이 방법으로 검출하는 것이 가능하다.

항체에는, polyclonal 항체와 monoclonal 항체가 있다. Polyclonal 항체를 만들기 위하여서는 토끼의 항원을 주사하여 면역시키고, 항체가 형성되어졌을 때 채혈하고 혈청(항혈청)을 검출한다. Western blotting에서는 이것을 그대로 희석하여 이용하는 경우도 있고, 그리고 항원 column을 이용하여 특이적 항체를 정제하여 이용하는 경우도 있다. 어느 쪽이든 더욱 좋다고 말할 수 없지만, 항혈청으로서 깨끗하다면 정제할 필요는 없다.

Monoclonal 항체를 만들기에는 면역한 마우스로부터 항체 생산세포를 분리하여 배양하고, 그로부터 목적의 단백질에 대한 항체를 생산하는 세포를 선별하여 clone화하고 이것을 배양 중 또는 마우스의 복수 중에서 증식시킨 항체를 회수한다. 한 개의 clone은 한 조율의 항체밖에 만들지 못하기 때문에 다른 항체를 포함하지 않는 대신 특이성이 높은 것이 기대되어진다. 그리고 항체는 보통 항원의 비교적 작은 영역 (10개의 아미노산 이하) 을 인식하기 때문에 의외의 교차반응이 나타나고, 전혀 관계없는 단백질과 반응하는 경우도 있다. 

항체는 종류에 따라 항체가나 특이성에 의한 큰 차이가 있기 때문에, 처음에 조건을 잘 검토하여야 한다. 특히 사용시 희석률은 결정적인 영향을 미치기 때문에 후술하는 바와 같은 요령으로 최적농도를 결정한다.

밴드가 검출되었다면, 그것이 목적 단백질의 것인지 아닌지를 검토하지 않으면 안된다. 예상 분자량과 잘 맞는지를 대충 눈으로 확인하지만, 수절이나 protease에 의한 분해 때문에 본래의 분자량과 같은 위치에 signal이 나타나는 것도 있고, 역으로 간혹 목적 단백질과 같은 분자량의 위치에 non-specific band로 나타나는 것도 있기 때문에 신중히 검토하지 않으면 안된다. 검출되어진 signal이 정말로 목적 단백질에 의한 것인지를 확인하기 위하여서는 흡수 실험 (일차원 항체용액에 항원을 혼합) 이 바람직하다. 혹시, 정제한 항원이 대량으로 필요하기 때문에 일차 항체가 없는 대조구도 꼭 수집하여 둔다.



1. 단백질 membrane의 전사와 Ponceau S 염색

SDS-PAGE의 gel로부터 단백질을 membrane에 전사하기 위하여서는 전용의 장치 (protein 장치) 를 사용하여 단백질을 전기적으로 이동시킨다. Protein 장치에는 semi-dry 식과 tank 식이 있지만, semi-dry 식이 buffer가 적게 사용되어짐으로 인하여 비교적 잘 이용되어진다. 그러나, semi-dry 식에는 고분자량의 단백질의 전사 효율이 나쁜 결점이 있기 때문에 buffer의 선택에 약간의 주의가 필요하다.

잘 사용되는 membrane에는 nitrocellulose막과 PVDF막이 있지만, 일반적으로 실험에서는 nitrocellulose막으로 충분하다. PVDF막은 일반적으로 고가이지만, 단백질과 흡착력이 매우 강하며, 또한 잘 부서러지지 않기 때문에 re-probe 할 경우 등에 적당하다. 그리고, 단백질을 막 위에 protease 처리할 경우에는 PVDF 막을 이용한다.

전사시킬 때의 buffer에는 몇 가지의 선택이 있다. 전사시에느느 먼저, 단백질을 gel로부터 전압에 따라 이동시키고 최종적으로 membrane과 결합시키지 않으면 안된다. 잘 이용되어지는 pH는 8정도의 buffer이며, 고분자의 단백질은 gel과 상호작용이 강하고 gel을 분리하기 어렵기 땜누에 120~150kDa 이상의 단백질을 semi-dry 방식으로 전사할 경우는 alkali성 영동 buffer를 사용하는 것이 좋다. 그리고, methanol의 영향은 영동중에 SDS가 단백질로부터 쉽게 떨어지기 때문에 등전점이 높은 단백질은 영동하기 어려운 점도 있다. 따라서 강한 염기성의 단백질의 경우도 alkali성의 염기성 buffer를 사용하는 것이 좋다. 역으로 alkali성으로 영동할 경우는 저분자의 단백질은 membrane으로부터 쉽게 분리 되어진다.

전사가 완료되어지면, membrane을 Ponceau S로 염색하고 전사가 잘 되었는지를 확인함과 동시에 분자량 marker 단백질의 위치를 조사한다. 염색에는 이 외에도 여러 가지 방법이 있지만, Ponceau S는 가역적으로 단백질과 결합하고 용이하게 탈색되어지기 때문에 marker의 lane만을 자를 필요가 없으므로, 조작이 간단하다. 탈색이 잘 되면 항체와의 반응에는 영향을 미치지 않는다. 검출감도는 gel을 CBB로 하는 것보다 다소 낫다.



2. 항체와의 반응과 항원의 검출

지금부터는 항체를 이용한 항원 단백질의 검출방법을 나타낼 것이다. 단백질을 전사시킨 membrane은 항체와의 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 blocking 처리를 한다. Blocking은 여러 가지 용액이 이용되지만, 최초의 선택으로서는 1~3%의 BSA나 gelatin을 함유한 Tween-PBS, 또는 단순히 Tween-PBS가 적당하다. 비특이적 흡착은 주로 소수성으로 상호작용에 의한 것으로 생각되어지지만, Tween과 같은 계면 활성제는 membrane의 소수성의 부분에 흡착하고 이것을 효과적으로 block할 수 있는 잇점이 있다. Skim milk(1~5% in Tween-PBS)는 blocking이 보다 강력하기 때문에 잘 이용되어지지만, 특이적 반응까지 제어하는 경우가 있다. 

Blocking이 끝나면 일차 항원과 반응시킨다. 이때 항체의 농도가 높으면 관계없는 단백질과 비특이적으로 반응하기도 하고, membrane 전체가 검게 나타날 수 있다. 역으로 농도가 너무 낮으면, 목적 단백질은 검출되지 않을 수도 있다. 따라서 처음 사용하는 항체는 희석율을 변화시켜서 (예를 들면 *200, *500, *1000, *2000, *5000, *10000, 일차 항체 없이) 최종농도를 검토하지 않으면 안된다. 이와 같은 경우에는 1매의 gel에 같은 sample을 여러 lane에 영동하고 전사시킨 membrane을 Ponceau S 염색한 후 1매씩 잘라 반응시킨다.

이차 항체는 보통 Horseradish peroxidase (HRP)나 alkaline phosphatase (AP) 표식한 제품으로 시판되어지고 있는 항체를 사용한다. 일차 항체가 토끼로부터 생산된 항체의 경우에는 표식한 항 토끼 IgG, mouse로부터 생산되어진 항체의 경우에는 표식한 항 mouse IgG를 사용하고 monoclonal의 경우에는 IgG가 아닌 IgM으로 되어 있는 경우, 그리고 마우스가 아닌 rat의 경우도 있기 때문에 잘 확인하여야 할 필요가 있다.

HRP의 검출에는 발생법과 화학 발광법이 있다. 대표적인 발색 시약으로서는 diaminobenzidine (DAB) 이 알려져 있다. 이것은 녹색으로 발색하는 시약으로서 감도도 좋고, 면역조직 화학실험에도 널리 이용되어지고 있다. 한편, 미약하지만 발암성이 있기 때문에 주의하여 취급하여야 한다. 최근 DAB법에 반하여 화학 발광법이 표준적인 방법으로 이용되어지고 있다. 화학 발광법에는 membrane을 반응액과 반응시킨 후 발색되어진 X선 film에 의하여 검출한다. 고감도로서 contrast도 좋고 사진촬영도 쉽다. AP의 검출법에는 BCIP/NBT를 기질로 이용한 발색법과 CDP-Star, 또는 CSPD를 이용하는 화학 발광법이 있다. 


* Western blotting의 troubleshooting *

원 인	대 책
밴드가 많이 나타날 때
항체의 희석율과 특이성에	일차 항체의 농도 검정을 다시 측정 (일차 항체 없이 control도)
	이차 항체의 농도를 검정한다
	일차 항체를 affinity 정제한다
영동한 단백질량이 너무 많으면	영동한 단백질량을 측정한다
block이 불충분한게 된다	blocking을 1시간 이상 overnight 한다
밴드가 전혀 나타나지 않음
항체역가가 약하거나 희석률이 부적당	반드시 알고 있는 일차 항체를 positive control로 하고, 일차 항체, 이차 항체의  농도 검정을 다시 할 것
block이 약할 경우	blocking을 1시간 정도로 늘리고, 일차 항체를 overnight로 반응시킴
항원이 적을 경우	영동한 단백질을 증가시킨다
검출법이 적당하게 없을 때	DAB법으로 검출되지 않을 경우는 화학 발광법으로 검출한다
적당한 buffer가 없을 때	Tween-PBS를 Tween-PBS (Tris buffer) 등으로 교환한다
Membrane 전체가 검을 경우
blocking이 불충분	반드시 Tween을 넣은 blocking액을 사용하고, overnight로 block한다
항체가 변성하여 있는 경우	표식한 proteinA로 검출한다

3. 밴드의 정량

1) Scanner 또는 CCD 카메라를 이용한 방법
  Western의 membrane이나 여과지 위에서 건조시킨 gel에서는 컴퓨터용의 scanner로 검출하는 것이 가능하다. CCD 카메라 이용이 가능하다면 그것으로 충분하다. 한편, 전기영동한 gel이나 X선 필름과 같은 투명한 sample이라면 정량성이 적고 깨끗한 화상을 얻기 위하여서는 투과광으로 사진을 찍을 수 있다. Scanner에 투과 원고 unit를 부착하여 사용하면 아주 간단하게 사진화 할 수 있다. CCD 카메라를 이용할 경우는 light focus에 sample을 놓고 실시하면 좋다. 컴퓨터에 저장한 화상을 정량하는 sample에서는 Macintoshi용의 NIH 이미지는 종전부터 널리 이용되고 있다. 화상을 TIFF형식으로 보존하면 NIH-image로 호환이 가능하다. 선택 sil(사각 점선)로 배선을 지정하여 analyze-measure 과정으로 측정하고 analyze-show result 과정으로 측정치가 표시되어 진다. 화상이 화면으로부터 나타나면 sil을 자유자재로 화면에서 움직일 수 있는 장점이 있다. 한편, X선 필름이라도 scanner가 가능하며, 처음부터 정량을 목적으로 만들어진 것이 아니라면 화상을 시각적으로 잘 나타낼 수 있도록 설계되어 있지만, 입력하는 빛의 강도와 signal의 강도가 반드시 정확하게는 직선관계가 되지 않는다. 그러한 반면, 수치로 나타낼 경우에는 상기의 어느 방법일지라도 충분하다.


2) 화학발광 검출용의 고감도 CCD카메라를 이용한 방법  
 화학발광의 signal은 고감도의 냉각 CCD 카메라를 이용하여 직접 검출하는 것이 가능하며, 그렇기 때문에 CCD 카메라 파스컴의 set가 시판되어지고 있다. X선 film을 사용하지 않는 분은 직선성이 손상되지 않고 dynamic 레인지도 광범위하다. 그리고 전용 set가 있다면 직선성과 같은 결과가 얻을 수 있게 설계되어 있기 때문에 이러한 것을 이용하여 보아도 좋을 것으로 생각한다.


3) 125I를 이용한 방법
  Film나 digital 기기를 이용한 방법으로서 125I 표식의 이차 항체 (또는 protein A)를 사용하고, autoradiography 후 membrane으로부터 밴드를 잘라 r-counter로서 측정하는 방법이 있다. 밴드를 잘라낼 때 background를 제외시키는 것이 의외로 어렵지만, 간단하고 우수한 방법으로 알려져 있다. 검출에는 RI image analyzer를 사용하여도 무방하다.


4) Radioimmunoassay 
  항원을 보다 정확하게 정량하는 방법에는 radioimmunoassay나 enzymeimmuno-assay가 있다, 중요한 혈중의 인자 등은 assay kit가 시판되어 있지만, 일반적으로 생화학, 분자생물학의 연구자가 자기 스스로 system을 확립하는 기회는 거의 없고 상세히 기술한 도서가 있기 때문에 그러한 책을 참고하여야 한다.


[참고 문헌]
 Antibodies, Harlow, E & Lane, D., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988