View source for Measuring microbial growth

<p>Population growth는 cell 전체 무게의 약간의 구성요소의 중량 또는 cell의 숫자의 변화에 따라서 측정 가능하다.&nbsp; 전자의 경우는 protein, nucleic acids 또는 cells 그들 자체의 dry weight가 가능하다.&nbsp; Cell을 세기 위한 다른 실험 방법 또는 존재하는 cell 무게를 어림하는 것은 다른 organisms나 다른 문제들과 잘 조화되어 있어서 여러가지 문제를 생각해 보아야 한다.<br /><br />1. Direct measurements of microbial growth : Total and viable counts<br /><br />총 세포의 수, 그리고 cell을 셀 수 있는 가능한 실험 방법에는 microorganisms의 단일 cell을 세기 위하여 두 가지 널리 사용되는 것이 존재한다.&nbsp; 각각의 절차는 그들의 힘의 강하기와 약함을 가지고, 그리고 종종 single bacterial culture에 존재하는 cell의 수를 세기 위해서 서로 다른 결과가 발생하기도 한다.<br /><br />-Total cell count<br /><br />Population의 cells의 총 숫자는 Direct microscopic count라고 불리는 실험 방법을, 현미경 아래에서 sample을 세어 봄으로써 측정할 수 있다.&nbsp; Direct microscopic counts의 두 가지 종류로는, 하나는 slides 위에서 sample을 건조 시키는 방법이고, 다른 하나는 sample이 액체 상태에 있는 것이다.&nbsp; 액체 sample과 함께, 특별한 counting chambers가 사용된다.&nbsp; Counting chamber에서, glass slides의 표면에 바둑판 무늬 모양의 기준 선망이 표시되어 있고, 각각이 사각형 모양으로 되어 있다.&nbsp; 바둑판 무늬 모양의 기준 선망 위에 그려진 각각의 사각형은 잘 알려진 총 합계의 부피이고, 매우 작지만 정확하게 측정할 수 있다.&nbsp; 바둑판 무늬 모양의 기준 선망의 한 단위 지역 안의 cell의 수는 현미경 아래에서 셀 수 있고, 작은 공간(chamber) 부피에서의 cell의 숫자의 측정이 가능하다.&nbsp; 현탁액의 적은 양의 milliliter 내 cells의 숫자의 중요성은 chamber sample의 부피 위에서 기초한 factor의 전환에 따라서 곱해줌으로써 쉽게 측정할 수 있다는 점이다.<br />현미경으로 cell 수를 세는 방법은 microbial cell number를 어림하는 데 빠른 방법 중 하나이다.&nbsp; 그러나 이 방법에서는 한계가 있다.<br />①죽은 cell과 살아있는 cell을 구별할 수 없고, ② 작은 cells는 세기가 어려워서 가끔 세지 못하고 놓치는 경우도 있다.&nbsp; ③ 그렇기 때문에 정확하지 않을 수도 있고, ④ 현미경으로 관찰하기 때문에 염색이 필요한데, 염새깅 되지 않았을 경우에는 위상차 현미경을 필요로 한다.&nbsp; ⑤ 진한 현탁액의 경우 cell의 개수가 너무 많아서 세기가 어려우므로 몇 차례의 희석이 필요하고,&nbsp;⑥ cell이 고정된 상태가 아니기 때문에 전부 세기 전에 이동을 할 수도 있다.<br />미생물의 생태계에서, 전체 cell을 세기 위하여 자연 상태의 sample을 사용하거나, 눈으로 볼 수 있도록 cell에 맞는 특별한 염색을 해서 관찰을 한다.&nbsp; [[DNA]]를 특이적으로 염색하는 시약인 DAPI는 sample의 모든 cell을 염색할 수 있다.&nbsp; 이와 대조적으로, fluorescent stains는 특별한 organisms 또는 그들의 핵산 probes에 붙을 수 있는 organisms의 group을 특이적으로 염색할 수 있다.&nbsp; 만약 cells가 낮은 densities로 나타난다면, 예를 들어 open ocean water sample의 경우, 그들은 처음에는 농도를 걸러내야 하고, 염색을 한 후에나 관찰이 가능 할 것이다.<br /><br />-Viabel count<br /><br />Direct microscopic counting에서, 죽은 cells와 살아있는 cells를 구분하지 못해서 두 종류 모두 세어야만 했다.&nbsp; 그러나, 많은 경우에서 우리는 오직 살아있는 cells만을 필요로 하고, 그래서 이러한 목적으로 인해서 viable count 실험 방법이 필요하다.&nbsp; Viable cell은 두 개로 나뉠 수 있고, 자손을 생성해 낼 수 있다.&nbsp; Viable count를 목적으로 하는 이러한 방법에서 사용하는 것은 촉촉한&nbsp;[[agar medium]]위에 형성된 [[colonies]]의 가능한 sample의 수를 샘으로써 cells의 숫자를 결정할 수 있다.&nbsp; 이러한 이유에서, viable counts는 종종 plate count 또는 colony count라고 불리기도 한다.&nbsp; Cell의 수를 세기 위한 절차의 이러한 종류에서 만들어지는 가정은 각각의 셀 수 있는 cell은 자랄 수 있고, 두 개로 나누어짐에 따라서 하나의 colony를 형성할 수 있다는 것이다. 어떤 염색적 절차는 또한 다양성을 나타낼 수 있다.&nbsp; 그러나, 이 colony를 이용한 실험 방법은 오직 살아있는 cell을 세기 위해서 필요한 방법이다.<br />Plate count의 목적으로 두 가지 실험 방법이 있다.&nbsp; 하나는 spread plate method이고 다른 하나는 pour plate method이다.&nbsp;<br />Spread plate method에서, 특유한 희석된 culture의 부피는(대게 0.1m 또는 이보다 더 적다) 멸균 상태인 [[glass spreader]]를 사용해서 agar plate의 표면 위에 sample을 깔아준다.&nbsp; 그런 다음, 이 plate를 incubator에 넣고 배양한 후, colonies가 형성되면, colonies의 수를 세면 된다.&nbsp; Plate의 표면이 충분히 말라서 깔린 용액이 스며들 수 있어야 하는 것은 상당히 중요하다.&nbsp; 이 실험을 위한 부피의 최대는 0.1ml인데 그 이유는 만약 더 많은 양을 사용하게 되면 용액이 agar에 충분히 스며들지 않아서 아마도 colones가 하나로 뭉쳐서 형성이 될 것이고, 이것은 아마도 다른 숫자를 나타나게 될 것이다.&nbsp; 그러므로 적은 양을 사용해야 한다.<br />Pour plate method는, culture의 알고 있는 부피(대게 0.1-1.0ml)가 매마른 Petri plate안에 들어가야 한다.&nbsp; 녹아 있는 agar medium은 [[benchtop]]에서 plate를 흔들어 줌으로써 잘 섞이게 해 주어야 한다.&nbsp; 왜냐하면, sample이 녹아있는 agar medium과 잘 섞여야 하고, spread plate에 비해서 더 큰 부피의 sample이 사용되기 때문이다.&nbsp; 그러나, organism을 세기 위한 이 실험 방법은 톡아있는 agar의&nbsp;온도(~45℃- 50℃)를 간단히 버티어낼 수 있음에 틀림이 없다.&nbsp; 이러한 실험 방법에서, colonies는 plate 구석 구석까지 퍼질 수 있어야 하고, spread plate method와 같이 agar plate위로 용액이 올라와서는 안된다.&nbsp; 이 plate는 그들 스스로 닫혀 있어야 하고, 모든 colonies가 자라나면 colonies를 셀 수 있다.<br /><br />-Diluting cell suspensions before plating<br /><br />Spread plate와 pour plate 실험 방법 두 가지 모두, 이것은 colonies의 숫자가 너무 많지 않도록 하는 것이 가장 중요하다.&nbsp; 어떤 cells가 plate에 너무 많이 모여 있으면 colonies가 형성되지 않을 것이고, 어떤 colonies는 합쳐질 것이며, colonies 수를 측정 하는 데 여러가지 문제점을 만들 것이다.&nbsp; 또한, colonies 수가 너무 적은 것도 문제가 되고, 또는 colonies의 숫자를 세어도, 통계적인 의미가 줄어들 것이다.&nbsp; 이러한 이유에서, 여러 번의 반복적인 실습을 통해서 얻어낸 가장 유효한 통계학적 수치는 plate 위에서 오직 30~300 개 사이의 colonies가 자라는 것이 가장 좋다.&nbsp; 무엇보다도, 이것은 incubation conditions(medium, 온도, 시간)에 따라서 결정이 되는데, 주어진 organism의 coloneis의 가장 최대의 숫자가 주어질 것이고,&nbsp; 이러한 조건을 통해서 자라나게 된다.<br />적당한 colonies의 수를 얻기 위해서, cell의 수를 세기 위한 sample은 대부분 거의 모두 희석을 해 주어야만 한다.<br />희석을 해 줄 때는 한 번만 해 주면 접근하기가 어려워 지므로 한 번 이상 여러 번 해 주는 것이 꼭 필요하다.&nbsp; 하나의 sample의 10-fold 희석이 일반적으로 사용된다.&nbsp; 10-fold(1/10)으로 희석해 주는 것은, 예를 들어서 희석액의 4.5ml과 함께 sample의 0.5ml을 섞어주거나 또는 희석액 9.0ml과 sample 1.0ml을 섞어주면 된다.&nbsp; 만약 100-fold(1/100) 희석이 필요하다면, 0.05ml의 sample을 4.95ml의 희석액과 섞어주거나 또는 0.1ml의 sample을 9.9ml의 희석액과 섞어주면 된다.&nbsp; 둘 중 하나를 선택해서, 1/100 희석은 10-fold 희석을 두 번 연속해서 수행 해 주면 된다,&nbsp; 대부분의 경우, 연속적인 희석의 경우는 마지막 희석을 필요로 하기에 수행한다.&nbsp; 그러므로, 만약 1/10⁴의 희석이 필요하다면, 이것은 1/100희석을 두 번 수행함으로써 도달할 수 있거나, 또는 1/10 희석을 네 번 수행함으로써 도달할 수 있다.&nbsp;&nbsp;<br /><br />-Sources of error in plate counting<br /><br />Cell의 수를 셀 수 있는 실험에서 얻어진 colonies의 숫자는 접종 재료의 크기와 이것의 생존력 뿐만 아니라 culture medium의 적당한 incubation 하는 시간에 따라 결정되기도 한다.&nbsp; 예를 들어, 만약 섞여 있는 culture를 사용한다면, plate에 침전 된 cells는 같은 비율의 colony로 자라날 수 없을 것이다,&nbsp; 만약 짧은 시간 동안 incubate한 cells는 최대의 숫자로 얻을 수 있는 colony 보다 훨씬 적은 수를 얻을 수 있을 것이다.&nbsp; 더군다나, colony의 숫자는 매우 다양하다.&nbsp; 만약 약간의 얇은 층의 colonies가 자라난다면, 그들은 아마도 수를 세는 동안 잃게 될 것이다.&nbsp; 순수 배양과 함께, colony 발달은 더욱 반복되는, 공통적인 방법으로 일어난다.<br />다양한 cell 수 세는 방법은 여러 가지 이유에서 많은 error를 제공한다.&nbsp; Pipetting의 변덕스러움을 포함해서, sample의 비동질성, 불충분한 mixing, 그리고 다른 여러 가지의 이유에서이다.&nbsp; 그러므로, 만약, 얻은 sample의 colony 수를 헤아리려면, 매우 주의해야 하고, sample의 준비와 pipetting, 그리고 주요 희석의 반복적인 plate의 준비에 매우 주의를 기울여야 한다.&nbsp; 덩어리의 두 개 혹은 그 이상의&nbsp;cells에서 하나의 colony 만 형성 될 것이다.&nbsp; 그래서 만약 많은 덩어리들이 sample에서 나타난다면, 실패율이 매우 낮은 상태로 sample을 셀 수 있을 것이다.&nbsp; 셀 수 있는 상태의 결과가 매우 깨긋한 상태라면 이&nbsp;data는 종종 viable cells(하나 혹은 더 많은 cells로 구성된 colony 형성 unit)의 수 보다 colony forming units(cfu)의 수로 제공 될 것이다.&nbsp; 이것은 plate에서 자랄 수 있는 것들의 colony를 샜다는 것이 더 타당하다.<br />Viable counts 임에도 불구하고, sample에서 셀 수 있는 cells의 숫자의 가장 좋은 정보는 microbiology의 많은 지역에서 넓게 사용될 수 있다.&nbsp; 예를 들어, 음식, 낙농업, 의약, 그리고 aquatic microbiology에서 다양하게 셀 수 있는 colony는 일상적으로 사용될 수 있는 예이다.&nbsp; 이러한 재료는 높은 예리함의 효력을 가지고 있고, 단일의 셀 수 있는 cell로 구성된 sample은 이론적으로 셀 수가 있다.<br /><br />-The great plate count anomaly<br /><br />매우 섬세한 기술을 가지고 있지만, 토양이나 물 같은 자연 상태의 samples의 전체 cell의 수를 평가하는 데 사용 할 때는 plate counts를 믿을 수가 없다.&nbsp; 게다가 자연 상태의 samples의 direct microscopic count는 다른 주어진 culture medium의 plates에서 다시 발견되는 더 많은 organisms를 보여준다.<br />왜 plate counts 하는 것은 direct microscopic counts를 하는 것 보다 더 적은 수의 cells를 보이는 것일까?<br />하나의 이유는 microscopic 실험 방법은 죽은 cell도 셀 수 있지만, viable 실험 방법은 살아 있는 cell만 셀 수 있기 때문이다.<br />무엇보다도, 심저어 매우 작은 sample의 다른 종류의 organisms는 아마도 실험실의 culture에서의 상태와 영양분 요구량의 차이 때문에 광대하게 나타날 수도 있다.&nbsp; 그러므로, 하나의 medium과 growth conditions의 하나의 set는 전체 population의 부분 집합의 growth를 할당할 것이다.<br />만약 이 부분집합이 형성된다면, 예를 들어, 10의 9승배 cell/g의 전체 viable population에서 10의 6승배 cell/g이라면, plate count는 전체 population의 오직 0.1%만 보일 것이다.&nbsp; 이것은 viable cells의 실제 가능한수의 최소치이다.<br /><br />2. Indirect measurements of microbial growth : Turbidity<br /><br />Cell의 숫자의 측정의 유용한 실험 방법 중 빠르게 사용할 수 있는 것은 turbidity measurements이다.&nbsp; Cell 현탁액은 눈으로 보았을 때 구름이 낀 것 처럼 탁하게 보이는데, 이것은 현탁액을 통과한 빛이 사방으로 흩어졌기 때문이다.&nbsp; Cell이 많으면 많을수록 흩어지는 빛의 양도 많아지고, 이러한 현탁액은 더 흐리게 보인다.&nbsp; Turbidity는 photometer 또는 spectrophotometer로 측정할 수 있는데 현탁액을 통과한 빛이 장치를 지나가면 굴절되지 않고 장치에 도달한 빛이 얼마나 되는 지 그 정도를 측정한다.&nbsp; 이 두 가지 장치의 주요 차이점은 photometer는 일반적으로 들어간 빛을 하나의 광범위한 일정 범위의 주파수의 전류만 통과시키는 장치를 사용하고, 이와 대조적으로 spectrophotometer는 좀 더 정확한 프리즘을 사용하거나 투사된 빛을 서로 다르게 끼워 넣는 것을 사용한다.&nbsp; 일반적으로 박테리아의 turbidity 측정에 널리 사용되는 wavelengths의 투사광은 540nm(녹색광), 600nm(오렌지광), 660nm(붉은색광) 이다.&nbsp; 이에 대해 언급하자면, spectrophotometers와 photometers 둘 다 굴절되지 않은 빛을 측정한다는 사실이다.&nbsp; Cell의 수가 증가했을 때 일어나는 굴절되지 않은 빛의 감소는 photometer units에서 측정되거나(예를 들어, &quot;Klett units(Klett-summerson photometer) spectrophotometer의 optical density(OD) unit에서 측정될 수 있다.<br /><br />-Generating a standard curve<br /><br />단일 cell organisms를 위해서, photometer 또는 OD는 cell의 수에 비례한다(확실한 한계점도 함께 존재한다.)&nbsp;.&nbsp; Turbidity readings는 direct counting methods를 위해서 대신하여 사용할 수 있다.&nbsp; 그러나, 그 전에, standard curve가 먼저 준비되어야 하고, cell number의 direct 측정(현미경 또는 viable count 이용), 또는 turbidity에 의해서 주어지는 indirect measurment, 그리고 무게(dry weight)가 있어야 한다.&nbsp; 예를 들어, standard curve는 cell 숫자와 cell 무게 둘 모두의 자료를 이용해서 구성할 수 있고, 단일의 turbidity reading으로부터 두 parameter의 계산을 위해서 준비되어야 한다.<br />높은 cell 농도에서, 하나의 cell로부터 감광계로부터 투과된 빛은 다른 cell에 의해서 다시 투과될 수 있다.&nbsp; </p>