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</font><strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffff99"><strong>2. 항체와의 반응과 항원의 검출<br /><br /></strong><font style="BACKGROUND-COLOR: #ffffff">지금부터는 항체를 이용한 항원 단백질의 검출방법을 나타낼 것이다. 단백질을 전사시킨 membrane은 항체와의 비특이적 흡착을 방지하기 위하여 blocking 처리를 한다. Blocking은 여러 가지 용액이 이용되지만, 최초의 선택으로서는 1~3%의 BSA나 gelatin을 함유한 Tween-PBS, 또는 단순히 Tween-PBS가 적당하다. 비특이적 흡착은 주로 소수성으로 상호작용에 의한 것으로 생각되어지지만, Tween과 같은 계면 활성제는 membrane의 소수성의 부분에 흡착하고 이것을 효과적으로 block할 수 있는 잇점이 있다. Skim milk(1~5% in Tween-PBS)는 blocking이 보다 강력하기 때문에 잘 이용되어지지만, 특이적 반응까지 제어하는 경우가 있다.&nbsp;<br /><br />Blocking이 끝나면 일차 항원과 반응시킨다. 이때 항체의 농도가 높으면 관계없는 단백질과 비특이적으로 반응하기도 하고, membrane 전체가 검게 나타날 수 있다. 역으로 농도가 너무 낮으면, 목적 단백질은 검출되지 않을 수도 있다. 따라서 처음 사용하는 항체는 희석율을 변화시켜서 (예를 들면 *200, *500, *1000, *2000, *5000, *10000, 일차 항체 없이) 최종농도를 검토하지 않으면 안된다. 이와 같은&nbsp;경우에는 1매의 gel에 같은 sample을 여러 lane에 영동하고 전사시킨 membrane을 Ponceau S 염색한 후 1매씩 잘라 반응시킨다.<br /><br />이차 항체는 보통 Horseradish peroxidase (HRP)나 alkaline phosphatase (AP) 표식한 제품으로 시판되어지고 있는 항체를 사용한다. 일차 항체가 토끼로부터 생산된 항체의 경우에는 표식한 항 토끼 IgG, mouse로부터&nbsp;생산되어진 항체의 경우에는 표식한 항 mouse IgG를 사용하고 monoclonal의 경우에는 IgG가 아닌 IgM으로 되어 있는 경우, 그리고 마우스가 아닌 rat의 경우도 있기 때문에 잘 확인하여야 할 필요가 있다.<br /><br />HRP의 검출에는 발생법과 화학 발광법이 있다. 대표적인 발색 시약으로서는 diaminobenzidine (DAB) 이 알려져 있다. 이것은 녹색으로 발색하는 시약으로서 감도도 좋고, 면역조직 화학실험에도 널리 이용되어지고 있다. 한편, 미약하지만 발암성이 있기&nbsp;때문에 주의하여 취급하여야 한다. 최근 DAB법에 반하여 화학 발광법이 표준적인 방법으로 이용되어지고 있다. 화학 발광법에는 membrane을 반응액과 반응시킨 후 발색되어진 X선 film에 의하여 검출한다. 고감도로서 contrast도 좋고 사진촬영도 쉽다. AP의 검출법에는 BCIP/NBT를 기질로 이용한&nbsp;발색법과 CDP-Star, 또는 CSPD를 이용하는 화학 발광법이 있다.&nbsp;<br /></font><br /strong></font><br />